【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及耐藥菌株，特別涉及一種結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變位點及檢測試劑盒。
技術介紹
1、結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，主要采用抗結核藥物治療，然而，在實際操作中，被檢測出患有耐多藥結核病（mdr-tb）或對一種關鍵抗結核藥物——利福平耐藥的結核病患者，并且參與到相應治療項目中的人數，遠少于根據流行病學模型估計的實際患病人數。一方面是有相當數量的耐多藥/利福平耐藥結核病患者沒有被發現或者沒有接受到適當的治療；另一方面是這些未被發現和治療的患者數量比預計的要多，這種情況可能會導致疾病在人群中的持續傳播，并使得控制結核病的努力變得更加困難。
2、為了讓耐藥患者能夠得到正確診斷并盡早開始最有效的治療方案，世衛組織終止結核病戰略呼吁普遍進行藥敏檢測，目前臨床上常用的藥敏檢測包括表型藥敏試驗和基因型檢測兩種，其中，結核分枝桿菌的表型藥敏試驗通常需要一個多月才能完成，需要昂貴、復雜的實驗室能力，并且對生物安全防護有很高的要求；而具有高度特異性和敏感性的核酸擴增檢測?(naat)?和全基因組測序?(wgs)?等基因型檢測方法有助于對患者進行及時準確的耐藥診斷。為了建立基因型耐藥性預測的全球標準，世界衛生發布了第一版結核分枝桿菌耐藥突變目錄來指導基因型檢測，該目錄中包括目前常見的抗結核藥物包括一線抗結核藥物（利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺），以及a組（左氧氟沙星、莫西沙星、貝達喹啉、利奈唑胺）、b?組（氯法齊明）和c組（德拉馬尼、阿米卡星、鏈霉素、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺）二線藥物的耐藥突變位點，大大改善了
3、然而，不同國家和地區的結核病耐藥突變位點各不相同，目前出具的結核分枝桿菌耐藥突變目錄統計出與藥物強相關的耐藥位點缺乏地域特征，同時對于二線藥物檢測的準確性和敏感性也普遍較低，由此造成的耐藥菌株假陽性和假陰性的檢測會影響患者的進一步治療。喹諾酮類藥物在結核分枝桿菌中的結合靶標是?dna?旋轉酶，它由兩個?a?亞基和兩個?b?亞基組成，分別由?gyra?和?gyrb?基因編碼，其中，gyra的第88位到第94位密碼子和?gyrb的第500位到第538位密碼子為喹諾酮類藥物耐藥性決定區，其內的非同義突變被確定為氟喹諾酮類藥物耐藥性的主要機制，gyrb基因發生氨基酸突變時會導致dna旋轉酶的三維結構發生變化，這些結構變化可能會影響氟喹諾酮類藥物與dna旋轉酶的結合部位，從而降低藥物對酶的抑制能力。
4、氟喹諾酮類藥物因具有抗菌譜廣、抗菌活性強、毒性較低、體內分布廣、給藥方便與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點而成為臨床常用的抗菌藥物，然而20年來由于其被廣泛用于治療未確診的呼吸道細菌感染，造成了較高的喹諾酮類藥物耐藥負擔，增加了其耐藥譜的復雜性。目前國內結核分枝桿菌喹諾酮類藥物耐藥率逐步攀升并且耐藥水平逐漸升高，其中，喹諾酮類藥物——莫西沙星已成為耐多藥/耐藥結核病治療方案中的關鍵a組藥物之一，因此，進一步提高分子生物學方法快速鑒定結核分枝桿菌喹諾酮類藥物耐藥性的檢出率和準確率對臨床耐藥性檢測和用藥具有指導意義。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變位點及檢測試劑盒，根據對結核分枝桿菌臨床菌株進行測序和篩選后得到結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物全新的耐藥突變位點，并基于耐藥突變位點設計檢測試劑盒，以定位檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥性。
2、為實現以上目的，第一方面，本技術方案提供了一種耐藥突變位點在檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥性中的應用，該耐藥突變位點為gyra_a288d、gyrb_g436d或gyrb_d434e，其中gyra_a288d為gyra基因編碼的蛋白質上位置288上的氨基酸丙氨酸被天冬氨酸所替代，gyrb_g436d為gyrb基因編碼的蛋白質上位置436上的甘氨酸被天冬氨酸所替代，gyrb_d434e為gyrb基因編碼的蛋白質上位置434上的天冬氨酸被谷氨酸所替代，檢測是否存在gyra_a288d、gyrb_g436d以及gyrb_d434e的任一或兩種以上組合的耐藥突變位點，所述應用為非診斷或治療領域中的應用。
3、本方案提供三種可用于預測結核對氟喹諾酮類藥物的耐藥性的耐藥突變位點，新發現的三個耐藥突變位點可在臨床上帶來非診斷或者治療的目的：比如可以為疾控部門提供重要的檢測方法和監控指標，有助于調整和優化耐藥性管理策略和抗結核藥物使用指南，減緩耐藥性的發展速度；可以為抗結核新藥物的研發提供重要線索，尤其是針對已存在耐藥的病原體，有助于開發新的藥物或藥物組合，以克服現有治療的局限性；可以有助于揭示結核分枝桿菌耐藥性發展的分子機制，加深研究人員對結核病發病機理的理解，為未來的治療策略提供科學依據。
4、本方案的gyra_a288d、gyrb_g436d以及gyrb_d434e通過對結核分枝桿菌進行抗生素耐藥測試后篩選耐藥強相關的突變位點得到。具體的，gyra_a288d、gyrb_g436d以及gyrb_d434e三個突變位點同左氧氟沙星耐藥性強相關，“gyra_a288d”影響了鄰接的?gyrb上loop的結構，限制了其運動突變后藥物脫離靶點所需能量顯著降低，增加了藥物脫靶的概率；而“gyrb_g436d，?gyrb_d434e”則可能會直接影響藥物結合位點同時也會造成其產物構象變化。
5、第二方面，本方案提供了一種檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變位點的引物組合，包括gyra擴增引物對以及gyrb擴增引物對，其中gyra擴增引物對包括引物序列如seq?id?no.1的gyra前向引物和引物序列如seq?id?no.2的gyra后向引物，gyrb擴增引物對包括引物序列如seq?id?no.3的gyrb前向引物和引物序列如seq?id?no.4的gyrb后向引物。
6、本方案提供的引物組合中的gyra擴增引物對用于擴增gyra基因的全長序列，gyrb擴增引物對用于擴增包含gyra_a288d、gyrb_g436d和gyrb_d434e的耐藥突變位點在內的耐藥突變區域。
7、關于引物組合的引物序列表如下表一所示：
8、表一?引物組合的引物序列表
9、
10、在一些實施例中，本方案提供的檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變位點的引物組合，用于對結核分枝桿菌進行擴增和測序以定位耐藥突變位點。本方案可進行一代或者二代測序以定位耐藥突變位點。
11、相較現有技術，本技術方案具有以下特點和有益效果：
12、通過對結核分枝桿菌進行抗生素測試儀篩選出在氟喹諾酮類藥物的情況下仍然能夠生長的耐藥菌株，并對耐藥菌株進行篩選分析后定位得到三個新發現的gyra_a288d、gyrb_g436d以及gyrb_d434e的耐藥突變位點，并針對于這三個耐藥突變位點設計引物組合以實現擴增定位，能夠實現對結核病病原體中氟喹諾酮類藥物耐藥位點的快速定位，使得患者可以更早獲得精確的耐藥性信息。<本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種耐藥突變位點在檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥性中的應用，其特征在于，該耐藥突變位點為gyrA_A288D、gyrB_G436D或gyrB_D434E，其中gyrA_A288D為gyrA基因編碼的蛋白質上位置288上的氨基酸丙氨酸被天冬氨酸所替代，gyrB_G436D為gyrB基因編碼的蛋白質上位置436上的甘氨酸被天冬氨酸所替代，gyrB_D434E為gyrB基因編碼的蛋白質上位置434上的天冬氨酸被谷氨酸所替代，檢測是否存在gyrA_A288D、gyrB_G436D以及gyrB_D434E的任一或兩種以上組合的耐藥突變位點，所述應用為非診斷或治療領域中的應用。
2.根據權利要求1所述的耐藥突變位點在檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥性中的應用，其特征在于，gyrA_A288D、gyrB_G436D以及gyrB_D434E通過對結核分枝桿菌進行抗生素耐藥測試后篩選耐藥強相關的突變位點得到。
3.根據權利要求2所述的耐藥突變位點在檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥性中的應用，其特征在于，gyrA_A288D、gyrB_G436D以及gyrB_D4
4.一種檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變位點的引物組合，其特征在于，包括gyrA擴增引物對以及gyrB擴增引物對，其中gyrA擴增引物對包括引物序列如SEQ?IDNO.1的gyrA前向引物和引物序列如SEQ?ID?NO.2的gyrA后向引物，gyrB擴增引物對包括引物序列如SEQ?ID?NO.3的gyrB前向引物和引物序列如SEQ?ID?NO.4的gyrB后向引物。
5.根據權利要求4所述的檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變位點的引物組合，其特征在于，引物組合中的gyrA擴增引物對用于擴增gyrA基因的全長序列，gyrB擴增引物對用于擴增包含gyrA_A288D、gyrB_G436D和gyrB_D434E的耐藥突變位點在內的耐藥突變區域。
...【技術特征摘要】
1.一種耐藥突變位點在檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥性中的應用，其特征在于，該耐藥突變位點為gyra_a288d、gyrb_g436d或gyrb_d434e，其中gyra_a288d為gyra基因編碼的蛋白質上位置288上的氨基酸丙氨酸被天冬氨酸所替代，gyrb_g436d為gyrb基因編碼的蛋白質上位置436上的甘氨酸被天冬氨酸所替代，gyrb_d434e為gyrb基因編碼的蛋白質上位置434上的天冬氨酸被谷氨酸所替代，檢測是否存在gyra_a288d、gyrb_g436d以及gyrb_d434e的任一或兩種以上組合的耐藥突變位點，所述應用為非診斷或治療領域中的應用。
2.根據權利要求1所述的耐藥突變位點在檢測結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥性中的應用，其特征在于，gyra_a288d、gyrb_g436d以及gyrb_d434e通過對結核分枝桿菌進行抗生素耐藥測試后篩選耐藥強相關的突變位點得到。
3.根據權利要求2所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙雁林，歐喜超，裴少君，龔弘強，王健，趙冰，宋澤萱，何萍，王吉春，毛凌峰，吳斯豪，楊狄，
申請(專利權)人：杭州柏熠科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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