【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于滅活疫苗領域，具體涉及一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗及其制備方法。
技術介紹
1、豬支原體肺炎(mps)又稱地方性流行性肺炎，是由豬肺炎支原體(mycoplasmahyopneumoniae，mhp)引起的一種接觸性慢性呼吸性傳染病。豬肺炎支原體mhp是一種微小的微生物，主要寄生于豬的呼吸道上皮細胞中，通過破壞上皮表面的纖毛影響黏膜清除系統，進而影響呼吸道的免疫系統。mhp一旦感染，其菌株在動物體內會持續存在至少12周，這意味著感染后的動物免疫反應不能迅速將其從呼吸道中清除，因此，mhp還可能使動物容易同時感染其他病原體，包括細菌、寄生蟲和病毒等。此外，mhp可以通過直接接觸或空氣飛沫在豬群之間傳播，感染后的豬主要表現為長時間的咳嗽和氣喘、呼吸困難、生長遲緩等癥狀，且這些癥狀可能會逐漸加重，在嚴重的情況下，可能導致豬的死亡。這些患病豬剖解時以肺部病變為主，出現“肉變樣”或“胰變樣”等實質性病變。
2、目前，豬支原體肺炎在世界范圍內高度流行，mhp感染主要影響豬的生長和發育，由于不同階段的豬均能感染豬支原體肺炎，傳染性強，感染率高，常常繼發其他病原的感染，導致飼料利用率降低，出欄時間延長，給豬業養殖造成非常明顯的影響，帶來重大經濟損失。
3、為了預防和控制豬支原體肺炎，養殖戶需要采取一系列的措施。其中，疫苗接種是防治豬支原體肺炎的重要方法。但是，mhp的生長條件相對較為特殊，體外培養條件苛刻，對營養成分的要求較高，需要特定的營養物質來維持其生長和繁殖。然而，目前對于mhp的營養需求了解尚不全面，
4、因此，針對豬支原體肺炎菌種體外培養技術、豬支原體肺炎疫苗的制備技術等進行研究，探索新的mhp疫苗制備技術和策略，具有非常重要的意義。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的問題，本專利技術旨在提供一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗及其制備方法，針對豬支原體肺炎菌種體外培養技術、豬支原體肺炎疫苗的制備技術等進行改進，制備疫苗的工藝簡單且所制備的滅活疫苗免疫動物后免疫效果好，提高了疫苗的質量。
2、為了達到上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、本專利技術的第一個目的是提供一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗，所述滅活疫苗為佐劑混合疫苗，由蛋白濃度為200～250μg/ml的滅活豬肺炎支原體菌液與isa76vg佐劑按照1:1～3的體積比混合組成。
4、優選的，所述滅活豬肺炎支原體菌液的培養方法包括：
5、(1)一級種子繁殖：將豬肺炎支原體生產用菌種按5～15％比例接種于含5～15％豬肺浸液的mh液體培養基，30～40℃培養，培養基顏色變黃，ph值降至6.5～7.0時收獲菌液，作為一級種子；
6、(2)二級種子繁殖：將一級種子按10～18％比例接種于含5～15％豬肺浸液的mh液體培養基，30～40℃培養，培養基顏色變黃，ph值降至6.5～7.0時收獲菌液，作為二級種子；
7、(3)菌液繁殖：將二級種子按10～18％比例接種含5～15％豬肺浸液的mh液體培養基，30～40℃培養，培養基顏色變黃，ph降至6.5～7.0，收獲菌液，得到豬肺炎支原體菌液；
8、(4)將豬肺炎支原體菌液進行純粹檢驗和活菌滴度測定，然后加入滅活劑進行滅活，檢測滅活菌液蛋白濃度，制得滅活豬肺炎支原體菌液。
9、優選的，所述豬肺浸液是通過豬肺組織進行消化制備，具體包括如下步驟：
10、將豬肺組織按照質量體積比為2：20～30料液比添加磷酸鹽緩沖液制備勻漿；調節ph至6.0～8.0，加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶各3800～4200u/g，攪拌均勻；放入50～60℃的水浴鍋中反應，在10、20、30、90、180、300和360min時及時混勻；置于沸水中滅活8～15min；取出冷卻至室溫，無菌操作分裝至ep管中，2500～3000r/min離心3～8min去除沉淀，吸取上清分裝，置于-30～40℃保存。
11、優選的，步驟(4)中所述純粹檢驗，包括采用活菌純粹檢驗法對豬肺炎支原體菌液進行純粹檢驗。
12、優選的，所述活菌純粹檢驗法包括：將豬肺炎支原體菌液分別接種8～12％?mh液體培養基和0.1～0.5mlmh固體培養基，35～40℃培養觀察8～12日，觀察菌液生長情況和菌落形態，同時接種硫乙醇酸鹽培養基tg、酪胨瓊脂ga和鮮血瓊脂斜面培養基各2支，每支0.2ml，1支置35～40℃培養，1支置23～27℃培養；接種葡萄糖蛋白胨湯gp?1支，每支0.2ml，置23～27℃培養，觀察4～6日，記錄結果。
13、優選的，步驟(4)中所述活菌滴度測定包括：取11支無菌試管，每管裝4.5ml含5～15％豬肺浸液的mh液體培養基，在第1管加入0.5ml豬肺炎支原體菌液培養物，混合均勻后取0.5ml加入第2管，如此連續進行10倍系列稀釋至10-10，同時設未加菌液的含5～15％豬肺浸液的mh液體培養基為陰性對照，置37±1℃培養12～16日，以培養基ph下降0.5以下最末1管作為菌液的ccu。
14、優選的，步驟(4)中所述滅活劑為濃度為0.5～2.0％的硫柳汞溶液，其終濃度達到0.005～0.02％；加入滅活劑后置2～8℃滅活24小時，期間振搖2次；所述滅活菌液蛋白濃度應≥4.3mg/ml。
15、本專利技術的第二個目的是提供一種如上述豬支原體肺炎高效滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
16、s1、水相的制備：將滅活豬肺炎支原體菌液用緩沖液稀釋成蛋白濃度為200～250μg/ml的豬肺炎支原體菌液，制得水相；
17、s2、油相的制備：將76vg佐劑裝入滅菌瓶內，120～130℃高壓滅菌30～40分鐘，冷卻后備用，制得油相；
18、s3、乳化：將水相與油相按1:1～3(w/w)比例乳化；
19、s4、將乳化后的疫苗充分搖勻，進行定量分裝，加蓋密封，即得。
20、優選的，步驟s3中所述乳化過程包括：
21、先將油相加入剪切機內，1200～1800r/min攪拌的同時緩緩加入水相后，以10000～15000r/min攪拌3～10分鐘，制得油乳劑滅活疫苗。
22、優選的，所述緩沖液為tris-nacl緩沖液。
23、本專利技術的設計原理或構思：
24、本專利技術提供了一種創新的疫苗制備方法，該方法的核心在于采用了一種獨特且優化的培養基，本專利技術采用含5～15％豬肺浸液的mh液體培本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述滅活疫苗為佐劑混合疫苗，由蛋白濃度為200～250μg/mL的滅活豬肺炎支原體菌液與ISA76VG佐劑按照1:1～3的體積比混合組成。
2.根據權利要求1所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述滅活豬肺炎支原體菌液的培養方法包括：
3.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述豬肺浸液是通過豬肺組織進行消化制備，具體包括如下步驟：
4.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，步驟(4)中所述純粹檢驗，包括采用活菌純粹檢驗法對豬肺炎支原體菌液進行純粹檢驗。
5.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述活菌純粹檢驗法包括：將豬肺炎支原體菌液分別接種8～12％MH液體培養基和0.1～0.5mLMH固體培養基，35～40℃培養觀察8～12日，觀察菌液生長情況和菌落形態，同時接種硫乙醇酸鹽培養基TG、酪胨瓊脂GA和鮮血瓊脂斜面培養基各2支，每支0.2mL，1支置35～40℃培養，1支置23～27℃培養；接種葡萄糖蛋白胨湯GP?
6.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，步驟(4)中所述活菌滴度測定包括：取11支無菌試管，每管裝4.5mL含5～15％豬肺浸液的MH液體培養基，在第1管加入0.5mL豬肺炎支原體菌液培養物，混合均勻后取0.5mL加入第2管，如此連續進行10倍系列稀釋至10-10，同時設未加菌液的含5～15％豬肺浸液的MH液體培養基為陰性對照，置37±1℃培養12～16日，以培養基pH下降0.5以下最末1管作為菌液的CCU。
7.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，步驟(4)中所述滅活劑為濃度為0.5～2.0％的硫柳汞溶液，其終濃度達到0.005～0.02％；加入滅活劑后置2～8℃滅活24小時，期間振搖2次；所述滅活菌液蛋白濃度應≥4.3mg/mL。
8.一種如權利要求1所述豬支原體肺炎高效滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟S3中所述乳化過程包括：
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液為Tris-NaCl緩沖液。
...【技術特征摘要】
1.一種豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述滅活疫苗為佐劑混合疫苗，由蛋白濃度為200～250μg/ml的滅活豬肺炎支原體菌液與isa76vg佐劑按照1:1～3的體積比混合組成。
2.根據權利要求1所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述滅活豬肺炎支原體菌液的培養方法包括：
3.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述豬肺浸液是通過豬肺組織進行消化制備，具體包括如下步驟：
4.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，步驟(4)中所述純粹檢驗，包括采用活菌純粹檢驗法對豬肺炎支原體菌液進行純粹檢驗。
5.根據權利要求2所述的豬支原體肺炎高效滅活疫苗，其特征在于，所述活菌純粹檢驗法包括：將豬肺炎支原體菌液分別接種8～12％mh液體培養基和0.1～0.5mlmh固體培養基，35～40℃培養觀察8～12日，觀察菌液生長情況和菌落形態，同時接種硫乙醇酸鹽培養基tg、酪胨瓊脂ga和鮮血瓊脂斜面培養基各2支，每支0.2ml，1支置35～40℃培養，1支置23～27℃培養；接種葡萄糖蛋白胨湯gp?1支，每支0.2ml，置23～27℃...
【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴悌昆，黃淑芬，張逸彬，馬軍，朱煒斌，
申請(專利權)人：廣東漁躍生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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