【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學與生物，具體涉及一種變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la及其構建方法和應用。
技術介紹
1、固氮微生物在常溫常壓下將空氣中的氮氣還原成銨，為植物生長提供一定量的氮素。但生物固氮是一個高耗能過程，每還原1分子氮合成2分子銨，需要消耗16個atp，因此生物固氮受產物銨的嚴格調控，即：高濃度的氮抑制生物固氮。不同的固氮微生物采用不同的調控機制控制固氮基因的表達。
2、變棲克雷伯氏菌(klebsiella?trevisan)是一種固氮細菌。變棲克雷伯氏菌具有生長速度快、固氮酶活性高的特點。與其他大多數固氮菌類似，這個菌的缺點是，只有在貧瘠的土壤中固氮效率高，而在肥沃的土壤(氮含量高)中的固氮效率低。現代農業體系中氮肥的大量使用導致土壤中的氮含量高。高濃度的氮抑制固氮基因(編碼固氮酶)表達，則導致固氮效率很低。
3、在變棲克雷伯氏菌(k.trevisan)中，20個固氮基因構成8個轉錄單位(nifj、nifhnifd?nifk?nift?nify、nife?nifn?nifx、nifu?nifs?nifv、nifw?nifz?nifm、niff、niflnifa、nifb?nifq)，這20個固氮基因簇集在24kb的染色體dna區域。該20個固氮基因中，除nifl和nifa兩個基因是調控基因外，其他18個基因編碼的蛋白產物參與固氮酶的合成。調控基因nifl和nifa組成一個轉錄單位，共用一個啟動子，nifl和nifa的轉錄受ntrb和ntrc的調控。nifa是正調控蛋白，激活其他固氮基因的表達；
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la及其構建方法和應用。本專利技術以變棲克雷伯氏菌(klebsiella?trevisan)為出發菌株構建了變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la。對負調控基因nifl進行敲除、同時插入不受氮調控的tc啟動子驅動正調控基因nifa表達。nifl基因缺失和nifa上游啟動子被tc啟動子取代的工程菌株突破高濃度銨對固氮作用的抑制。變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la為耐銨和泌銨固氮微生物，提高在高銨條件下的固氮酶活性，突破了高濃度銨對生物固氮的抑制作用，提高了泌銨能力。
2、為了實現本專利技術目的，本專利技術的技術方案如下：
3、本專利技術提供了一種變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la，所述工程菌株fb-la以變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan的基因組為基礎，缺失nifl基因編碼區的部分序列，然后插入tc啟動子且tc啟動子位于nifa基因上游；其中，nifl基因的核苷酸序列為seq?id?no:1所示；所述tc啟動子的核苷酸序列為seq?id?no:2所示。
4、進一步地，所述缺失nifl基因的部分序列的核苷酸序列為seq?id?no:3所示；所述變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan為變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan?fb006，其保藏編號為cctcc?no：m?20232710。
5、本專利技術還提供了一種上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la的構建方法，包括以下步驟：
6、(1)將nifl基因的部分序列和tc啟動子插入載體質粒pgpgmr中，得到重組質粒pgpgmr-la；
7、(2)以慶大霉素gm為篩選標記，將所述重組質粒pgpgmr-la轉入大腸桿菌sm10，
8、(3)將含有重組質粒pgpgmr-la的大腸桿菌與變棲克雷伯氏菌液體培養物混合培養，篩選得到攜具有amp和gm抗性的變棲克雷伯氏菌的接合子；
9、(4)連續傳代培養單交換菌株，利用amp抗性，篩選發生第二次交換的雙交換菌株，該工程菌株稱為變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la。
10、進一步地，所述步驟(1)中，重組質粒pgpgmr-la的構建方法如下：
11、a.以變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan基因組dna為模板，利用引物對up-f/up-r，擴增nifl上游同源臂；其中，引物對up-f/up-r如下：
12、up-f：cgacggatcccaagcttcttctacagcacggtgcgtttaatc如seq?id?no:4所示，
13、up-r：gtttgttgaaggcgttatcgagcatcatattc如seq?id?no:5所示；
14、b.以變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan基因組dna為模板，利用引物對down-f/down-r擴增nifl下游同源臂；其中，引物對down-f/down-r如下：
15、down-f：aatttacgacaactggcttcgcgaccgc如seq?id?no:6所示，
16、down-r：taacaatttgtggaattcccgcgccgcgcagttaaatttg如seq?id?no:7所示；
17、c.以phy300plk質粒dna為模板，利用引物對la-f/la-r擴增tc啟動子；其中，引物對la-f/la-r如下：
18、la-f：cgataacgccttcaacaaacgggccatattg如seq?id?no:8所示，
19、la-r：gaagccagttgtcgtaaattcgattgtgaatag如seq?id?no:9所示；
20、d.載體質粒pgpgmr被限制性內切酶xbaⅰ和smaⅰ雙酶切，然后，利用gibsonassembly?master?mix(new?england?biolabs)，將nifl上游同源臂片段、nifl下游同源臂片段、tc?promoter片段，以及xbaⅰ和smaⅰ雙酶切的質粒pgpgmr片段，進行組裝，組裝得到重組質粒pgpgmr-la。
21、本專利技術還提供了一種上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la在提高固氮酶活性或泌銨能力中的應用。
22、本專利技術還提供了一種上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la在促進植物生長中的應用。
23、進一步地，所述植物為經濟作物。
24、再進一步地，所述經濟作物為水稻、黃瓜和番茄中任意一種。
25、本專利技術還提供了一種促進植物生長的菌劑，所述菌劑含有上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la。
26、再進一步地，所述植物為水稻、黃本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種變棲克雷伯氏菌工程菌株FB-LA，其特征在于，所述工程菌株FB-LA以變棲克雷伯氏菌Klebsiella?trevisan的基因組為基礎，缺失nifL基因編碼區的序列，然后插入Tc啟動子且Tc啟動子位于nifA基因上游；其中，nifL基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1所示；所述Tc啟動子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2所示。
2.根據權利要求1所述耐銨和泌銨固氮微生物，其特征在于，所述缺失nifL基因的部分序列的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:3所示；所述變棲克雷伯氏菌Klebsiella?trevisan為變棲克雷伯氏菌Klebsiella?trevisan?FB006，其保藏編號為CCTCC?NO：M?20232710。
3.一種權利要求1所述的變棲克雷伯氏菌工程菌株FB-LA的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種變棲克雷伯氏菌工程菌株FB-LA的構建方法，其特征在于，所述步驟(1)中，重組質粒pGPGmR-LA的構建方法如下：
5.一種權利要求1所述的變棲克雷伯氏菌工程菌株FB-
6.一種權利要求1所述的變棲克雷伯氏菌工程菌株FB-LA在促進植物生長中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用；其特征在于，所述植物為經濟作物。
8.根據權利要求7所述的應用；其特征在于，所述經濟作物為水稻、黃瓜和番茄中任意一種。
9.一種促進植物生長的菌劑，其特征在于：所述菌劑含有權利要求1所述的變棲克雷伯氏菌工程菌株FB-LA。
10.根據權利要求9所述的菌劑，其特征在于：所述植物為水稻、黃瓜和番茄中任意一種。
...【技術特征摘要】
1.一種變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la，其特征在于，所述工程菌株fb-la以變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan的基因組為基礎，缺失nifl基因編碼區的序列，然后插入tc啟動子且tc啟動子位于nifa基因上游；其中，nifl基因的核苷酸序列為seq?id?no:1所示；所述tc啟動子的核苷酸序列為seq?id?no:2所示。
2.根據權利要求1所述耐銨和泌銨固氮微生物，其特征在于，所述缺失nifl基因的部分序列的核苷酸序列為seq?id?no:3所示；所述變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan為變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan?fb006，其保藏編號為cctcc?no：m?20232710。
3.一種權利要求1所述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la的構建方法，其特征在于，包...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王仁宗，陳三鳳，田冠，汪元發，
申請(專利權)人：湖北富邦科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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