【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)屬于培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)及應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
1、牙釉質(zhì)位于牙齒表面，為人體最堅(jiān)硬組織，具有美觀、咀嚼、保護(hù)牙齒等功能，然而由于齲病、外傷、遺傳缺陷等原因，牙釉質(zhì)經(jīng)常出現(xiàn)缺損。在牙齒發(fā)育過(guò)程中，成釉細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生釉質(zhì)，但其在人類(lèi)牙齒萌出后喪失，致使牙釉質(zhì)受損后無(wú)法再生，亦使人體內(nèi)缺乏研究釉質(zhì)發(fā)育與遺傳突變的細(xì)胞資源。
2、人類(lèi)多能干細(xì)胞可從人成體細(xì)胞經(jīng)重編程而獲得，并可分化為成體組織的任意一種細(xì)胞，為成釉細(xì)胞再生提供優(yōu)異“種子細(xì)胞”，然而，成釉細(xì)胞發(fā)育、分化周期較長(zhǎng)、調(diào)控因子較復(fù)雜，已探明100多種生物因子參與成釉細(xì)胞發(fā)育調(diào)控，然而主控成釉細(xì)胞分化的“配方”仍不完全清楚。目前，現(xiàn)有技術(shù)中誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞分化為成釉細(xì)胞的方式包括：（1）與小鼠牙胚間充質(zhì)共培養(yǎng)；（2）與人牙髓干細(xì)胞共培養(yǎng)；（3）使用鼠源性成釉細(xì)胞條件培養(yǎng)液。
3、然而，現(xiàn)有技術(shù)中的誘導(dǎo)策略存在以下不足之處：（1）誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞成釉向分化的成分仍不明確，無(wú)法高效、大批量誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞分化為成釉細(xì)胞；（2）采用共培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)成釉細(xì)胞后，無(wú)法從混合細(xì)胞中分離成釉細(xì)胞；（3）體外誘導(dǎo)的成釉細(xì)胞并不能再現(xiàn)體內(nèi)成釉細(xì)胞的極化形態(tài)，分化程度不充分。
4、近年來(lái)，生物小分子在多能干細(xì)胞定向分化領(lǐng)域備受青睞，與生物蛋白相比，其價(jià)格低廉、儲(chǔ)存方便，可大大降低使用成本，更利于推廣應(yīng)用；與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，其更安全、簡(jiǎn)易、可量化調(diào)節(jié)，因而得以廣泛應(yīng)用。然而，主控人類(lèi)多能干細(xì)胞分化為成
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于此，本申請(qǐng)一實(shí)施例提供一種誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。
2、本申請(qǐng)一方面提供一種誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基，包含培養(yǎng)基i、培養(yǎng)基ii和培養(yǎng)基iii；
3、所述培養(yǎng)基i包含dmem/f12、敲除血清替代品、l-谷氨酰胺、非必須氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗、sb431542和bmp4蛋白；
4、所述培養(yǎng)基ii包含dmem/f12、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、b27添加劑、青霉素-鏈霉素雙抗、bmp4蛋白、視黃酸和氯化鋰；
5、所述培養(yǎng)基iii包含dmem/f12、胎牛血清、β-甘油磷酸鈉、維生素c、氯化鈣、青霉素-鏈霉素雙抗、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和氯化鋰。
6、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基i包含dmem/f12培養(yǎng)基以及15v/v%~20v/v%敲除血清替代品、1.5mm~2.5mm?l-谷氨酰胺、0.8×10-4m~1.2×10-4m非必須氨基酸、0.5v/v%~1.0v/v%青霉素-鏈霉素雙抗、10μm~20μm?sb431542和10ng/ml~25ng/ml?bmp4蛋白。
7、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基ii包含dmem/f12培養(yǎng)基以及15ng/ml~25ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、20ng/ml~30ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子、1.0v/v%~2.0v/v%?b27添加劑、0.5v/v%~1.0v/v%?青霉素-鏈霉素雙抗、10ng/ml~25ng/ml?bmp4蛋白、0.5μm~1.0μm視黃酸和18mm~22mm氯化鋰。
8、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基iii包含dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及8v/v%~12v/v%胎牛血清、10mm?~20mm?β-甘油磷酸鈉、45μg/ml~55μg/ml維生素c、1.5mm~2.5mm氯化鈣、0.5v/v%~1.0v/v%青霉素-鏈霉素雙抗、8ng/ml~12ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、2.5ng/ml~3.5?ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和14mm~16mm氯化鋰。
9、本申請(qǐng)另一方面提供一種誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的方法，包括：采用所述的誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基，培養(yǎng)人類(lèi)多能干細(xì)胞。
10、在其中一個(gè)實(shí)施例中，包括：將人類(lèi)多能干細(xì)胞于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5~1天；更換為培養(yǎng)基i培養(yǎng)2~2.5天，再更換為培養(yǎng)基ii培養(yǎng)2.5~3天；最后更換為培養(yǎng)基iii培養(yǎng)5~6天，獲取成釉細(xì)胞；
11、所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含mtesr?1培養(yǎng)基和y27632。
12、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述人類(lèi)多能干細(xì)胞于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)前還包括預(yù)培養(yǎng)、消化以及傳代的步驟。
13、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述人類(lèi)多能干細(xì)胞于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)前的代數(shù)為2~8代，細(xì)胞密度為60%~70%，細(xì)胞分化比例<5%。
14、在其中一個(gè)實(shí)施例中，消化的步驟包括：加細(xì)胞消化液，于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中游離人類(lèi)多能干細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液。
15、在其中一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)方法具有如下技術(shù)特征中的一個(gè)或者多個(gè)：
16、（1）培養(yǎng)過(guò)程中每1~2日更換培養(yǎng)基；
17、（2）于37℃，5%co2的條件下培養(yǎng)；
18、（3）將人類(lèi)多能干細(xì)胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠包被過(guò)的培養(yǎng)容器；
19、（4）傳代的步驟包括按照1:10~1:15的傳代比例將細(xì)胞懸液接種至基質(zhì)膠包被過(guò)的培養(yǎng)容器。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包含培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II和培養(yǎng)基III；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基I包含DMEM/F12培養(yǎng)基以及15v/v%~20v/v%敲除血清替代品、1.5mM~2.5mM?L-谷氨酰胺、0.8×10-4M~1.2×10-4M非必須氨基酸、0.5v/v%~1.0v/v%青霉素-鏈霉素雙抗、10μM~20μM?SB431542和10ng/mL~25ng/mLBMP4蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基II包含DMEM/F12培養(yǎng)基以及15ng/mL~25ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、20ng/mL~30ng/mL堿性成纖維生長(zhǎng)因子、1.0v/v%~2.0v/v%B27添加劑、0.5?v/v%~1.0v/v%?青霉素-鏈霉素雙抗、10ng/mL~25ng/mL?BMP4蛋白、0.5μM~1.0μM視黃酸和18mM~22mM氯化鋰。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基III包含DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及8v/v%~12v/
5.一種誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的方法，其特征在于，包括：采用權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基，培養(yǎng)人類(lèi)多能干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括：將人類(lèi)多能干細(xì)胞于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5~1天；更換為培養(yǎng)基I培養(yǎng)2~2.5天，再更換為培養(yǎng)基II培養(yǎng)2.5~3天；最后更換為培養(yǎng)基III培養(yǎng)5~6天，獲取成釉細(xì)胞；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述人類(lèi)多能干細(xì)胞于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)前還包括預(yù)培養(yǎng)、消化以及傳代的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述人類(lèi)多能干細(xì)胞于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)前的代數(shù)為2~8代，細(xì)胞密度為60%~70%，細(xì)胞分化比例<5%。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，消化的步驟包括：加細(xì)胞消化液，于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中游離人類(lèi)多能干細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5~9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)方法具有如下技術(shù)特征中的一個(gè)或者多個(gè)：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種誘導(dǎo)人類(lèi)多能干細(xì)胞定向分化為成釉細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包含培養(yǎng)基i、培養(yǎng)基ii和培養(yǎng)基iii；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基i包含dmem/f12培養(yǎng)基以及15v/v%~20v/v%敲除血清替代品、1.5mm~2.5mm?l-谷氨酰胺、0.8×10-4m~1.2×10-4m非必須氨基酸、0.5v/v%~1.0v/v%青霉素-鏈霉素雙抗、10μm~20μm?sb431542和10ng/ml~25ng/mlbmp4蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基ii包含dmem/f12培養(yǎng)基以及15ng/ml~25ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、20ng/ml~30ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子、1.0v/v%~2.0v/v%b27添加劑、0.5?v/v%~1.0v/v%?青霉素-鏈霉素雙抗、10ng/ml~25ng/ml?bmp4蛋白、0.5μm~1.0μm視黃酸和18mm~22mm氯化鋰。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基iii包含dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及8v/v%~12v/v%胎牛血清、10mm?~20mm?β-甘油磷酸鈉、45μg/ml~55μg/ml維生素c、1.5mm~2.5mm氯化鈣、0....
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：苗辛超，吳哲，黃超儀，石凱凱，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院廣州醫(yī)科大學(xué)羊城醫(yī)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。