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    蛋白分析用血樣供試品的制備方法以及癌癥血樣蛋白圖譜庫的構建方法技術

    技術編號:43106124 閱讀:15 留言:0更新日期:2024-10-26 09:48
    本發明專利技術涉及一種蛋白分析用血樣供試品的制備方法以及癌癥血樣蛋白圖譜庫的構建方法。本申請將血樣和納米顆粒孵育制備“蛋白冠”(即蛋白?納米顆粒復合)后再對“蛋白冠”上穩定結合的蛋白進行還原、變性、烷基化和酶解,并對所得酶解產物進行脫鹽處理,特別是于合適的條件下還原、變性、烷基化、酶解和脫鹽處理,從而形成特定的蛋白分析用血樣供試品制備工藝。采用該工藝對血樣進行處理,操作簡單,耗時短,成本低,易于推廣和應用,并且所得供試品中低豐度蛋白種類多。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及醫學診斷,具體涉及蛋白分析用血樣供試品的制備方法以及癌癥血樣蛋白圖譜庫的構建方法


    技術介紹

    1、癌癥是困擾人類健康的重大疾病之一,目前大多數癌癥在發現時即是中后期以致大多數患者錯過了最佳治療時期。由于缺乏特定的生物標志物,使得癌癥的臨床篩選和早期檢測非常困難。因此需要尋找新的癌癥相關的生物標志物,用于實現癌癥的診斷,進而提高患者的生存率。

    2、人血漿(或血清)是發現疾病生物標志物的一種特別理想的生物液體,因為血液在臨床中是常規采集的,且采集方法是微創的,檢測方法相對便宜。人體血液中的蛋白幾乎與所有的器官、組織、細胞密切相關,血液蛋白的變化直接反映機體的病理、生理狀態,如疾病發生的早期或者中后期通常是機體分泌到血漿或血清中的異常蛋白質,且大部分和疾病相關的生物標志物都和血液中的低豐度蛋白相關。然而由于血液中的蛋白存在組成復雜且蛋白豐度差異大的特點,使得目前基于質譜的血清蛋白組學技術只能鑒定到血液中的高豐度蛋白,無法實現對低豐度蛋白的檢測。

    3、為了提高血樣的檢測深度,在對血樣進行檢測分析(包括采用液相色譜-串聯質譜進行檢測分析)之前,需要去除其中最豐富的蛋白質,目前已經開發有去除血清中高豐度的蛋白質的試劑盒,但是價格昂貴。傳統的去除血清中的高豐度蛋白主要采用高ph反相(rp)分餾法,能產生高數量的低豐度蛋白。但是,采用高ph反相(rp)分餾法進行血樣處理,操作過程繁瑣,經濟成本高。

    4、有鑒于此,特提出本申請。


    技術實現思路

    1、本申請實施例的目的包括提供一種蛋白分析用血樣供試品的制備方法,該制備方法操作簡單,成本低。

    2、在本申請的第一方面,提供一種蛋白分析用血樣供試品的制備方法,所述制備方法包括制備蛋白-納米顆粒復合物的步驟,對所述蛋白-納米顆粒復合物上的蛋白進行還原、變性、烷基化和酶解的步驟,以及從所得酶解產物中分離上清液并對所述上清液進行脫鹽處理的步驟;

    3、制備蛋白-納米顆粒復合物的步驟包括:

    4、混合血樣和納米顆粒,孵育,固液分離,收集沉淀,用氯化鈉溶液對所述沉淀進行洗滌,制備蛋白-納米顆粒復合物。

    5、在本申請的一些實施例中,制備蛋白-納米顆粒復合物的步驟滿足(1)至(7)所示條件中的一個或者多個:

    6、(1)所述納米顆粒選自sio2納米顆粒、聚苯乙烯納米顆粒、fe2o3-nh2納米顆粒、fe2o3-cooh納米顆粒、zr-mof納米顆粒或者其組合;

    7、(2)所述納米顆粒的直徑范圍為100nm-300nm;

    8、(3)每0.5mg-5mg所述納米顆粒對應的所述血清的用量大于20μl;

    9、(4)孵育的條件包括:溫度為25℃-37℃,渦旋速度為700rpm-1000rpm,時間為0.5h-2h;

    10、(5)所述氯化鈉溶液中氯化鈉的濃度為100mm-200mm;

    11、(6)洗滌的次數為多次,可選地為2-3次,且多次洗滌的條件相同;洗滌的方式包括:吹打所述氯化鈉溶液和所述沉淀的混合物;以及,

    12、(7)固液分離的方式包括離心和/或磁吸;可選地,離心的條件包括:轉速為5000rpm-12000rpm,時間為2min-5min。

    13、在本申請的一些實施例中,將所述蛋白-納米顆粒復合物制備成混懸液后再對所述蛋白進行還原、變性、烷基化和酶解,所述混懸液的溶劑包含45mm-55mm的tris-hcl緩沖液。

    14、在本申請的一些實施例中,還原的步驟中,還原劑的終濃度為5mm-15mm。

    15、在本申請的一些實施例中,烷基化的步驟中,烷基化試劑的終濃度為15mm-25mm。

    16、在本申請的一些實施例中,酶解的步驟中,采用胰酶,所述胰酶與所述蛋白的質量比為1:(20-55)。

    17、在本申請的一些實施例中,所述制備方法滿足如下1)至5)項所示條件中的一個或者多個:

    18、1)還原的步驟滿足如下條件:還原劑包括二硫蘇糖醇,還原溫度為90℃-100℃,還原時間為10min-15min;

    19、2)變性的步驟滿足如下條件:變性劑包括尿素,所述尿素的終濃度為4m-8m,變性時間為25min-35min;

    20、3)烷基化的步驟滿足如下條件:烷基化試劑包括碘乙酰胺,避光,烷基化時間為25min-35min;

    21、4)酶解的步驟滿足如下條件:酶解溫度為36.5℃-37.5℃,酶解時間為12h-16h;以及,

    22、5)脫鹽處理的步驟滿足如下條件:采用c18柱,每100μl所述上清液分5次-6次加載到所述c18柱中,每次的加載耗時為2min-5min。

    23、在本申請的一些實施例中,所述血樣來自癌癥患者或者健康人。

    24、在本申請的一些實施例中,所述血樣為血清或者血漿。

    25、在本申請的第二方面,提供一種癌癥血樣蛋白圖譜庫的構建方法,所述構建方法包括如下步驟:

    26、采用第一方面中所述的制備方法,用健康血樣和癌癥血樣的混合物制備血樣供試品;以及,

    27、將血樣供試品的溶液采用hplc法進行分餾,將收集的餾分采用lc-ms/ms法的dda采集模式進行分析,將分析所得搜庫結果作為dia數據分析的譜圖庫,構建癌癥血樣蛋白譜圖庫。

    28、在本申請的一些實施例中,所述hplc法具有如(a)至(c)項所示條件中的一個或者多個:

    29、(a)色譜柱1為c18柱;

    30、(b)流動相1包括流動相a1和流動相b1,所述流動相a1為乙腈含量為2%(v/v)-5%(v/v)、乙酸銨含量為10mm-25mm的乙酸銨水溶液,所述流動相b1為乙酸銨含量為10mm-25mm且乙腈含量為70%(v/v)-98%(v/v)的乙腈水溶液;以及

    31、(c)采用梯度洗脫方式1進行分餾,可選地,梯度洗脫方式1的程序包括:

    32、0min-70min,所述流動相a1的體積占比由100%下降至55%;

    33、70min-75min,所述流動相a1的體積占比由55%下降至0%;

    34、75min-80min,所述流動相a1的體積占比保持0%;

    35、可選地,所述hplc法還包括如下(d)至(g)項所示條件中的一個或者多個:

    36、(d)進樣流速1為200μl/min-400μl/min;

    37、(e)檢測波長為214nm和280nm,帶寬為4nm;

    38、(f)進樣量為80μl-100μl;

    39、(g)分餾過程中,每個餾分的收集時間為80s-160s,共收集30管-60管;

    40、或/和,

    41、所述lc-ms/ms法具有如a)至c)項所示液相色譜條件中的一個或者多個:

    42、a)色譜柱2為c18柱;

    43、b)流動相本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    1.一種蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括制備蛋白-納米顆粒復合物的步驟,對所述蛋白-納米顆粒復合物上的蛋白進行還原、變性、烷基化和酶解的步驟,以及從所得酶解產物中分離上清液并對所述上清液進行脫鹽處理的步驟;

    2.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,制備蛋白-納米顆粒復合物的步驟滿足(1)至(7)所示條件中的一個或者多個:

    3.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,將所述蛋白-納米顆粒復合物制備成混懸液后再對所述蛋白進行還原、變性、烷基化和酶解,所述混懸液的溶劑包含45mM-55mM的Tris-HCl緩沖液。

    4.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,還原的步驟中,還原劑的終濃度為5mM-15mM。

    5.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,烷基化的步驟中,烷基化試劑的終濃度為15mM-25mM。

    6.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,酶解的步驟中,采用胰酶,所述胰酶與所述蛋白的質量比為1:(20-55)。

    7.根據權利要求1至6中任一項所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,所述制備方法滿足如下1)至5)項所示條件中的一個或者多個:

    8.根據權利要求1至6中任一項所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,所述血樣來自癌癥患者或者健康人;或/和,

    9.一種癌癥血樣蛋白圖譜庫的構建方法,其特征在于,所述構建方法包括如下步驟:

    10.根據權利要求9所述的癌癥血樣蛋白譜圖庫的構建方法,其特征在于,所述HPLC法具有如(A)至(C)項所示條件中的一個或者多個:

    11.根據權利要求9或者10所述的癌癥血樣蛋白圖譜庫的構建方法,其特征在于,所述血樣供試品的溶液中的溶劑包含甲酸含量為0.08%(v/v)-0.12(v/v)的甲酸水溶液。

    12.權利要求9至11中任一項所述的構建方法構建的癌癥血樣蛋白圖譜庫在癌癥診斷中的應用。

    ...

    【技術特征摘要】

    1.一種蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括制備蛋白-納米顆粒復合物的步驟,對所述蛋白-納米顆粒復合物上的蛋白進行還原、變性、烷基化和酶解的步驟,以及從所得酶解產物中分離上清液并對所述上清液進行脫鹽處理的步驟;

    2.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,制備蛋白-納米顆粒復合物的步驟滿足(1)至(7)所示條件中的一個或者多個:

    3.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,將所述蛋白-納米顆粒復合物制備成混懸液后再對所述蛋白進行還原、變性、烷基化和酶解,所述混懸液的溶劑包含45mm-55mm的tris-hcl緩沖液。

    4.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,還原的步驟中,還原劑的終濃度為5mm-15mm。

    5.根據權利要求1所述的蛋白分析用血樣供試品的制備方法,其特征在于,烷基化的步驟中,烷基化試劑的終濃度為15mm-25mm。

    6.根據權利要求1所述的...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:譚蔚泓劉遠王孟杰
    申請(專利權)人:中國科學院基礎醫學與腫瘤研究所籌
    類型:發明
    國別省市:

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