【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種豬鏈球菌保護(hù)性抗原蛋白檢測(cè)和該蛋白用于制作豬鏈球菌不同血清型交叉保護(hù)性抗原疫苗的應(yīng)用及其制備方法。
技術(shù)介紹
1、豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病原菌，可經(jīng)呼吸道、傷口等感染，豬發(fā)病后表現(xiàn)出腦膜炎、心肌炎、關(guān)節(jié)炎及敗血癥等癥狀。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)豬鏈球菌2、7、9型均具有較高的流行性，對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。
2、目前，我國(guó)對(duì)于豬鏈球菌病的預(yù)防和治療仍以抗生素為主，但近年來(lái)濫用抗生素的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，從而導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，疫病得不到有效防治，造成大面積擴(kuò)散，嚴(yán)重危害人獸健康。控制豬鏈球菌病上，疫苗對(duì)動(dòng)物疫病的預(yù)防發(fā)揮著重要作用，選擇安全、可靠的疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行接種，能夠使動(dòng)物產(chǎn)生高的抗體水平抵抗細(xì)菌的感染。
3、張安定、李書光等開(kāi)展的豬鏈球菌保護(hù)性抗原篩選和驗(yàn)證工作證實(shí)了反向疫苗學(xué)技術(shù)在開(kāi)展疫苗研發(fā)方面的可行性，而且也為開(kāi)發(fā)豬鏈球菌2、7、9型通用疫苗提供了參考。鑒于豬鏈球菌血清型較多，而目前缺乏針對(duì)不同血清型豬鏈球菌病原提供交叉保護(hù)的通用疫苗，因此開(kāi)展豬鏈球菌多血清型通用疫苗候選抗原的研究工作對(duì)該病的科學(xué)防控具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述問(wèn)題，本專利技術(shù)第一方面提供了一種豬鏈球菌免疫原性抗原蛋白在制備豬鏈球菌檢測(cè)試劑盒或豬鏈球菌不同血清型交叉保護(hù)性抗原疫苗方面的應(yīng)用。旨在為制作預(yù)防豬鏈球菌的不同血清型交叉保護(hù)性抗原疫苗提供便利，為感染豬鏈球菌所引發(fā)疾病的防控提供幫助。在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，所述豬
2、本專利技術(shù)首先根據(jù)protein數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)豬鏈球菌蛋白的描述，在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蛋白序列，通過(guò)tmhmm篩選蛋白的跨膜情況，vaxign預(yù)測(cè)蛋白疫苗特性，保留黏附參數(shù)在0.5以上的蛋白；隨后進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，刪除可能的信號(hào)肽序列，通過(guò)blast進(jìn)行不同血清型的蛋白比對(duì)，保留常見(jiàn)致病性血清型共有或者部分共有的蛋白質(zhì)序列，本專利技術(shù)所述的蛋白序列即為上述方法篩選到的其中一種，該蛋白名稱已經(jīng)被ncbi注釋，為細(xì)胞壁結(jié)合域(lpxtgcell?wall?anchor?domain-containing?protein)，ncbi登錄號(hào)為wp_014736444.1，申請(qǐng)人將該蛋白的編碼基因命名為5493基因，相應(yīng)的，其表達(dá)蛋白命名為5493蛋白。蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seq?id?no：3所示。
3、本專利技術(shù)第二個(gè)方面，提供了一種豬鏈球菌檢測(cè)試劑盒以及一種豬鏈球菌不同血清型交叉保護(hù)性抗原疫苗，所述試劑盒和亞單位疫苗中分別含有所述的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述試劑盒為間接elisa試劑盒或全血?dú)⒕噭┖校鼉?yōu)選地，所述間接elisa試劑盒可用于檢測(cè)選自豬鏈球菌血清型2型、7型和9型中的一種或多種的檢測(cè)，所述全血?dú)⒕噭┖锌捎糜跍鐨⑦x擇血清型為2型、7型和9型中的一種或多種豬鏈球菌。
4、本專利技術(shù)第三個(gè)方面，提供了該蛋白的制備方法，所述蛋白質(zhì)的制備方法如下：
5、1)以5493蛋白的基因組dna為模板，設(shè)計(jì)pcr引物擴(kuò)增編碼所述蛋白質(zhì)的目的基因；優(yōu)選地，所述pcr引物(5’-3’端)為：上游：gatatcggatccgagaattatccgtcacttgca(seqid?no：4)；下游ggccgcaagcttgttttttgacaagacaggcgctcaag(seq?id?no：5)。
6、2)將1)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pet30載體，獲得包含所述目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒；
7、3)將2)獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得包含所述蛋白質(zhì)的宿主菌；
8、4)從3)獲得的宿主菌中分離純化所述蛋白質(zhì)。
9、本專利技術(shù)的第四個(gè)方面，提供了優(yōu)化后的編碼該蛋白的多核苷酸序列。核苷酸序列如seq?id?no：2所示。
10、本專利技術(shù)的第五個(gè)方面，提供了一種生物材料，所述生物材料如1)-3)任一種：
11、1)包含權(quán)利要求9所述的多核苷酸序列，以及與之可操作連接、可指導(dǎo)蛋白序列在表達(dá)宿主中生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
12、2)包含1)所述的核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體。
13、3)包含轉(zhuǎn)化了1)所述的核酸構(gòu)建體或2)所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
14、本申請(qǐng)的有益效果包括但不限于：
15、1.根據(jù)本申請(qǐng)的豬鏈球菌病保護(hù)性抗原，將抗原蛋白與鋁膠佐劑混合免疫新西蘭白兔，在二次加強(qiáng)免疫以后抗體水平就呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，表明該抗原蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫效果。
16、2.根據(jù)本申請(qǐng)的豬鏈球菌病保護(hù)性抗原，全血?dú)⒕饔脤?duì)豬鏈球菌2、7、9型型明顯，與新西蘭白兔的攻毒保護(hù)效果結(jié)果一致。
17、3.根據(jù)本申請(qǐng)的豬鏈球菌病保護(hù)性抗原，該抗原蛋白的刺激對(duì)細(xì)胞因子il-17a、ifn-γ及i?l-10的作用明顯，表明該蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)對(duì)豬鏈球菌感染的免疫反應(yīng)。
18、4.根據(jù)本申請(qǐng)的豬鏈球菌病保護(hù)性抗原，在對(duì)蛋白的交叉保護(hù)評(píng)價(jià)試驗(yàn)中5493組兔的發(fā)病及死亡情況均減少，對(duì)豬鏈球菌2型、7型、9型的保護(hù)率分別為50％、50％、80％。
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1.氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-17A、IFN-γ及IL-10中一種或多種表達(dá)水平的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-17A、IFN-γ及IL-10中一種或多種表達(dá)水平的用途為提升細(xì)胞因子IL-17A、IFN-γ及IL-10中一種或多種的表達(dá)水平。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蛋白質(zhì)在制備豬鏈球菌檢測(cè)試劑盒或豬鏈球菌不同血清型交叉保護(hù)性抗原疫苗方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述豬鏈球菌選自血清型為2型、7型或9型豬鏈球菌中的一種或多種。
5.一種豬鏈球菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒是檢測(cè)豬鏈球菌間接ELISA試劑盒或全血?dú)⒕噭┖小?/p>
7.一種豬鏈球菌不同血清型交叉保護(hù)性抗原疫苗疫苗，其特征在于：所述疫苗中含有權(quán)利要求1中所述的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的制備方法
9.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ?IDNO：2所示。
10.生物材料，其特征在于，所述生物材料如1)-3)任一種：
...【技術(shù)特征摘要】
1.氨基酸序列如seq?id?no：3所示的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子il-17a、ifn-γ及il-10中一種或多種表達(dá)水平的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述調(diào)節(jié)細(xì)胞因子il-17a、ifn-γ及il-10中一種或多種表達(dá)水平的用途為提升細(xì)胞因子il-17a、ifn-γ及il-10中一種或多種的表達(dá)水平。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蛋白質(zhì)在制備豬鏈球菌檢測(cè)試劑盒或豬鏈球菌不同血清型交叉保護(hù)性抗原疫苗方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述豬鏈球菌選自血清型為2型、7型或9型豬鏈球菌中的一種或多種。
...【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王艷，李書光，呂素芳，張兵，王寒竹，任洪林，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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