【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及外泌體制備，具體涉及一種mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體及其制備方法。
技術(shù)介紹
1、間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(mscs-exosomes)是一種由間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)分泌的具有多功能的納米囊泡，是重要的細(xì)胞外通訊介質(zhì)。隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的深入研究，越來越多的研究認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體是調(diào)節(jié)生理和病理條件下的生化反應(yīng)和細(xì)胞活性的關(guān)鍵介質(zhì)，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以通過其攜帶的蛋白和rna成分的胞間轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)組織修復(fù)、減輕炎癥和調(diào)節(jié)免疫等功能。
2、盡管當(dāng)前諸多文獻表明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在促進組織修復(fù)、減輕炎癥和調(diào)節(jié)免疫等方面具有顯著潛力，然而，要將間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體應(yīng)用于實際的臨床治療或疾病管理中，仍需要不斷的研究和技術(shù)創(chuàng)新來進一步優(yōu)化和提升外泌體的功能，以實現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在臨床治療中的廣泛應(yīng)用。micrornas(簡稱mirnas)是長度為18～24個核苷酸的小非編碼rna，在轉(zhuǎn)錄后控制基因表達，是外泌體中發(fā)揮作用的主要活性物質(zhì)之一，通過提升外泌體中mirnas的含量，能夠增加外泌體的活性，進而提高外泌體功能。但是，目前通過間充質(zhì)干細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下制得的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中mirnas的含量較低，這限制了間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的功能以及在臨床治療中的應(yīng)用，仍需要進一步提升間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中mirnas的含量，從而進一步提高間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的功能。因此，亟需一種能夠提高間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中mirnas含量的外泌體制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、
2、本專利技術(shù)的另一目的在于提出一種mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，由上述mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法制備得到，本專利技術(shù)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中mirna的含量高。
3、為達此目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
4、一種mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，包括如下步驟：將pact表達載體轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞中，使間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)pact蛋白的表達量增加，然后收集細(xì)胞上清，對細(xì)胞上清進行處理，收集得到mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體；
5、所述pact表達載體包括載體骨架和編碼pact的核苷酸序列，所述編碼pact的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
6、優(yōu)選地，本技術(shù)方案mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法包括如下步驟：
7、(1)將pact表達載體和轉(zhuǎn)染試劑混合，得到轉(zhuǎn)染復(fù)合液；
8、(2)將間充質(zhì)干細(xì)胞接種至干細(xì)胞培養(yǎng)基中進行傳代，在第4次傳代48～96h后，向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液，轉(zhuǎn)染48～96h；
9、(3)收集干細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞上清，對細(xì)胞上清進行處理，收集得到mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。
10、優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)染復(fù)合液中所述pact表達載體的質(zhì)量和所述轉(zhuǎn)染試劑的體積的比值為1：(2～4)。
11、優(yōu)選地，在步驟(2)中，向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中所述pact表達載體的濃度為0.8～1.2mm。
12、優(yōu)選地，在步驟(2)中，向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述培養(yǎng)基中所述pact表達載體的濃度為1mm。
13、優(yōu)選地，所述對細(xì)胞上清進行處理包括如下操作方法：對細(xì)胞上清進行多次離心，去除漂浮細(xì)胞、死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，收集上清，過濾后再次離心收集沉淀，重懸，離心重懸液，收集沉淀，得到mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。
14、優(yōu)選地，所述載體骨架為pcdna3.1載體。
15、一種mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，由上述的mirna含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法制備得到。
16、本申請實施例提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果：本技術(shù)方案通過向間充質(zhì)干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pact表達載體，能夠增加間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)pact蛋白表達量，從而提高間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中的mirna的含量，進而提高間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的功能。本技術(shù)方案的制備方法不僅能夠提高間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中mirna的含量，顯著提高外泌體的功能，而且本技術(shù)方案的制備方法不需要昂貴的儀器設(shè)備，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本技術(shù)方案的制備方法和制得的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對于外泌體的臨床前研究和臨床應(yīng)用具有很大的推動作用，適于推廣應(yīng)用。
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1.一種miRNA含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將PACT表達載體轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞中，使間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)PACT蛋白的表達量增加，然后收集細(xì)胞上清，對細(xì)胞上清進行處理，收集得到miRNA含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的miRNA含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述轉(zhuǎn)染復(fù)合液中所述PACT表達載體的質(zhì)量和所述轉(zhuǎn)染試劑的體積的比值為1：(2～4)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的miRNA含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中所述PACT表達載體的濃度為0.8～1.2mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的miRNA含量高的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，向干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合液后，所述培養(yǎng)基中所述PACT表達載體的濃度為1mM。
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