【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種甘薯近緣野生種的遺傳轉化方法，屬于植物遺傳轉化。
技術介紹
1、據了解，甘薯近緣野生種具有豐富的遺傳多樣性和潛在的基因資源，如高淀粉、抗病蟲、耐病毒、抗寒抗旱等優良特性，對于豐富甘薯種質資源和品種改良有重要價值。其中，i.trifida是一種生長在加勒比海附近的甘薯近緣野生種，以二倍體、四倍體、六倍體等形式存在，它是栽培甘薯的野生祖先，是研究甘薯育種和分子分析的良好模式物種。目前對于甘薯六倍體的研究較多，目前對于甘薯六倍體的研究較多，但由于六倍體甘薯的遺傳背景復雜，轉化效率低，培育周期長，一些優良品種的選育很難維持。國內外對于甘薯的育種中已應用到了i.trifida，日本利用其培育出了高產抗線蟲且具有高淀粉特性的新品種南豐，而江蘇省農科院則利用它與甘薯雜交培育出了具有豐產，高淀粉以及抗病特性的新品系寧180和寧58-5。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是，克服現有技術的不足而提供一種甘薯近緣野生種的遺傳轉化方法，通過培育二倍體i.trifida的胚性愈傷組織，并調整培養參數，大大提高了遺傳轉化效率。
2、本專利技術提供一種甘薯近緣野生種的遺傳轉化方法，包括以下步驟：
3、步驟一、取甘薯近緣野生種的莖尖進行培養至出現胚性愈傷組織；轉至步驟二；
4、步驟二、將胚性愈傷組織在溫度為26～28℃的條件下進行光照培養，獲得致密的黃綠色胚性愈傷組織；轉至步驟三；
5、步驟三、將致密的黃綠色胚性愈傷組織進行胚性愈傷
6、步驟四、挑取致密的黃色胚性愈傷組織，將目的基因進行二倍體的遺傳轉化；轉至步驟五；
7、步驟五、取100～200mg/團、長勢良好并且穩定增殖的胚性愈傷組織，將浸染液與愈傷組織共培養；轉至步驟六；
8、步驟六、將經過共培養的愈傷組織進行過渡培養；轉至步驟七；
9、步驟七、將過渡培養的愈傷組織進行抗性篩選；轉至步驟八；
10、步驟八、將抗性篩選后的愈傷組織進行體胚發生。
11、本專利技術通過培育二倍體i.trifida的胚性愈傷組織建立遺傳轉化體系，具有遺傳背景較為簡單，轉化效率較高，培育周期短等優點，為今后甘薯在培育雜交新品系和基因工程方面提供了重要手段。
12、作為本專利技術進一步優化的技術方案如下：
13、進一步的，所述植物表達載體攜帶的目的基因為hyg抗性基因；所述甘薯近緣野生種品種為i.trifida、i.triloba、i.nil。
14、所述步驟一中，將i.trifida、i.trioloba、i.nil三種甘薯近緣野生種的莖尖分別接種于ms改良培養基中，進行16h光照和8h黑暗培養直至出現胚性愈傷組織，培養溫度為26～28℃；所述ms改良培養基為含0.5mg/l或1mg/l的4-fa、1mg/l或2mg/l的2,4-d、0.65mg/l或1.3mg/l的2,4,5-t的ms固體培養基。
15、本專利技術中，0.5mg/l?4-fa最有利于i.trifida的愈傷組織的誘導。4-fa、2,4-d、2,4,5-t這三種激素都可以誘導出i.nil愈傷組織，而且愈傷組織質量較好，呈金黃色；而這三種激素對i.triloba的誘導效果極差，誘導率低，誘導出的愈傷組織多呈現水漬化，后面即使對i.triloba的愈傷組織多次繼代培養，也沒有誘導出胚性愈傷組織。并且光照條件下的愈傷組織誘導率以及形成的愈傷狀態均比在黑暗條件下好；上述三種激素均無法誘導出i.triloba的胚性愈傷組織；i.nil的胚性愈傷組織誘導率均較高，但它無法形成完整的植株。因此，選擇二倍體i.trifida的胚性愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料。
16、所述步驟二中，胚性愈傷組織接種于含有0.5mg/l?4-fa和5.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中進行光照培養。所述步驟二中，光照培養條件為：16h光照和8h黑暗，溫度26～28℃。
17、所述步驟三中，將生長良好的胚性愈傷組織轉入含有0.5mg/l?4-fa和5.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中，進行胚性愈傷組織的增殖培養。
18、所述步驟四中，將目的基因通過農桿菌侵染法進行二倍體i.trifida的遺傳轉化。
19、所述步驟五中，將浸染液與愈傷組織置于0.5mg/l?4-fa、20mg/l?as和5.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中共培養。
20、所述步驟六中，將經過共培養的愈傷組織放入到含有0.5mg/l?4-fa、200mg/l?cef和5.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中進行過渡培養；過渡培養條件為：16h光照和8h黑暗，溫度為26～28℃，培養時間7天。
21、所述步驟七中，將過渡培養的愈傷組織置于0.5mg/l?4-fa、200mg/l?cef、10mg/lhyg和5.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中進行抗性篩選；抗性篩選條件為：16h光照和8h黑暗，溫度為26～28℃，培養時間為4周，2軸時更換一次培養基。
22、所述步驟八中，將抗性篩選后的愈傷組織放入200mg/l?cef、10mg/l?hyg、1mg/laba和5.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中進行體胚發生；體胚誘導的條件：16h光照和8h黑暗，溫度為26～28℃，培養時間1～2周。
23、本專利技術建立了甘薯近緣野生種i.trifida的遺傳轉化體系，通過農桿菌誘導二倍體i.trifida胚性愈傷組織，獲得轉基因植株的遺傳轉化體系的建立。首先采集甘薯近緣野生種二倍體i.trifida的芽尖進行剝離，獲得胚性愈傷組織，進行適當光照培養；胚性愈傷組織轉入培養基中進行增殖培養；選取取攜帶目的基因質粒的根癌農桿菌，制備侵染液；將胚性愈傷組織放入侵染液中進行侵染，侵染后的愈傷先黑暗培養后光照恢復培養；最后進行抗性愈傷的篩選，得到候選植株，對候選植株進行pcr檢測，將均為陽性的植株進行煉苗和移栽，得到二倍體i.trifida轉基因植株。總之，本專利技術通過培育二倍體i.trifida的胚性愈傷組織，并調整培養參數，大大提高了遺傳轉化效率。
24、與現有技術相比，本專利技術方法獲得的胚性愈傷組織轉化率高達16.5％，培育周期僅需4個月。同時，二倍體i.trifida的遺傳轉化體系可為規模化培育新品種、定向改造優良性狀和基因工程方面提供幫助。
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1.一種甘薯近緣野生種的遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述植物表達載體攜帶的目的基因為hyg抗性基因；所述甘薯近緣野生種品種為I.?trifida、I.?triloba、I.?nil。
3.根據權利要求2所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟一中，將I.?trifida、I.?trioloba、I.?nil三種甘薯近緣野生種的莖尖分別接種于MS改良培養基中，進行16h光照和8h黑暗培養直至出現胚性愈傷組織，培養溫度為26～28℃；所述MS改良培養基為含?0.5?mg?/?L?或1?mg?/?L?的4-FA、1?mg?/?L或2?mg?/?L的2,?4-D、0.65mg?/?L或1.3?mg?/?L的2,?4,?5-T的MS固體培養基。
4.根據權利要求1所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟二中，胚性愈傷組織接種于含有0?.?5mg/L?4-FA和5?.0g/L植物凝膠的MS改良培養基中進行光照培養；所述步驟二中，光照培養條件為：1
5.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟三中，將生長良好的胚性愈傷組織轉入含有0?.?5mg/L?4-FA和5?.0g/L植物凝膠的MS改良培養基中，進行胚性愈傷組織的增殖培養。
6.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟四中，將目的基因通過農桿菌侵染法進行二倍體I.?trifida的遺傳轉化。
7.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟五中，將浸染液與愈傷組織置于0.5?mg?/?L?4-FA、20?mg?/?L?AS和5?.0g/L植物凝膠的MS改良培養基中共培養。
8.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟六中，將經過共培養的愈傷組織放入到含有0.5?mg?/?L?4-FA、200?mg?/?L?Cef和5?.0g/L植物凝膠的MS改良培養基中進行過渡培養；過渡培養條件為：16h光照和8h黑暗，溫度為26～28℃，培養時間7天。
9.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟七中，將過渡培養的愈傷組織置于0.5?mg?/?L?4-FA、200?mg?/?L?Cef、10?mg?/?L?hyg和5.0g/L植物凝膠的MS改良培養基中進行抗性篩選；抗性篩選條件為：16h光照和8h黑暗，溫度為26～28℃，培養時間為4周，2周時更換一次培養基。
10.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟八中，將抗性篩選后的愈傷組織放入200?mg?/?L?Cef、10?mg?/?L?hyg、1?mg?/?L?ABA和5.0g/L植物凝膠的MS改良培養基中進行體胚發生；體胚誘導的條件：16h光照和8h黑暗，溫度為26～28℃，培養時間1～2周。
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1.一種甘薯近緣野生種的遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述植物表達載體攜帶的目的基因為hyg抗性基因；所述甘薯近緣野生種品種為i.?trifida、i.?triloba、i.?nil。
3.根據權利要求2所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟一中，將i.?trifida、i.?trioloba、i.?nil三種甘薯近緣野生種的莖尖分別接種于ms改良培養基中，進行16h光照和8h黑暗培養直至出現胚性愈傷組織，培養溫度為26～28℃；所述ms改良培養基為含?0.5?mg?/?l?或1?mg?/?l?的4-fa、1?mg?/?l或2?mg?/?l的2,?4-d、0.65mg?/?l或1.3?mg?/?l的2,?4,?5-t的ms固體培養基。
4.根據權利要求1所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟二中，胚性愈傷組織接種于含有0?.?5mg/l?4-fa和5?.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中進行光照培養；所述步驟二中，光照培養條件為：16h光照和8h黑暗，溫度26～28℃。
5.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟三中，將生長良好的胚性愈傷組織轉入含有0?.?5mg/l?4-fa和5?.0g/l植物凝膠的ms改良培養基中，進行胚性愈傷組織的增殖培養。
6.根據權利要求3所述一種甘薯近緣野生種遺傳轉化方法...
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