【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程，具體涉及一種源于烏賊皮的降血壓寡肽及應用。
技術介紹
1、高血壓(hypertension)是指以體循環動脈血壓(收縮壓和/或舒張壓)增高為主要特征，可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質性損害的臨床綜合征。高血壓是最常見的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險因素。另外，高血壓常見的并發癥有冠心病、糖尿病、心力衰竭、高血脂、腎病、周圍動脈疾病、中風、左心室肥厚等。在高血壓的各種并發癥中，以心、腦、腎的損害最為顯著。高血壓最嚴重的并發癥是腦中風，發生腦中風的概率是正常血壓人的7.76倍。因此，控制高血壓病人的血壓及并發癥對提高病人健康至關重要。
2、降壓藥物種類很多，如利尿降壓劑、中樞神經和交感神經抑制劑、腎上腺素能受體組滯劑、酶抑制劑、鈣離子拮抗劑、血管擴張劑、神經節和節后交感神經抑制劑、5-羥色胺受體拮抗劑等。血管緊張素轉換酶(ace)又稱肽基-羧基肽酶，是腎素-血管緊張素系統的關鍵酶，功能是將血管緊張素ⅰ轉換為血管緊張素ⅱ，在維持機體水鹽代謝、內環境穩定和調節心血管功能方面起著重要的作用。從而，ace成為治療高血壓、心力衰竭、2型糖尿病等疾病的有效靶點。ace抑制劑能抑制血管緊張素i的轉化，從根本上減少血管緊張素ii的生成，達到降低血壓的效果，所以ace抑制劑已被廣泛研究用于預防和控制高血壓。但人工合成的ace抑制劑具有多種不良副作用，與之相比，由蛋白酶在比較溫和的情況下水解蛋白質獲得的ace抑制肽具有原料來源廣泛、降血壓效果明顯且對正常血壓無影響、無副作用等優點，受到消費者和研究人員日益重視。
3、烏賊，是烏賊目烏賊科軟體動物，烏賊具有補益精氣、健脾利水、養血滋陰、溫經通絡、通調月經、美膚烏發的功效，可防止動脈硬化，提高免疫力，防止骨質疏松，緩解倦怠乏力，對食欲不振等效果顯著。烏賊加工過程中產生大量副產物，基于對副產物的再利用，本申請以烏賊加工副產物-烏賊皮為原料，制備一種烏賊皮降血壓寡肽，該寡肽顯示出顯著的降血壓效果和血管內皮細胞保護作用，可作為高血壓的治療藥物或者輔助治療產品進行開發。
技術實現思路
1、針對現有技術中存在的問題，本專利技術設計的目的在于一種源于烏賊皮的降血壓寡肽及應用。
2、一種源于烏賊皮的降血壓寡肽，其特征在于該降血壓寡肽的氨基酸序列為asp-gly-cys-met-gly-pro-trp(dgcmgpw)，esi-ms測定分子量為764.9da。
3、該降血壓寡肽采用以下步驟進行制備：
4、(1)烏賊皮的預處理：將烏賊皮解凍、洗凈，干燥，粉碎后過200目篩，按照1g:12～15ml加入乙酸乙酯，然后用超聲輔助脫脂，超聲脫脂完成后，混合物溶液于9000rmp離心10～15min，收集固體物，重復上述操作三次，最后干燥，得到脫脂烏賊皮粉末。
5、(2)烏賊皮酶解液的制備：將上述脫脂烏賊皮粉末按照料液比1g:6～9ml加入到巴比妥鈉-鹽酸緩沖液(0.04mol/l)，調節混合液ph值至7.0～7.5，調溫度至45～50℃，按照烏賊皮粉末質量的2.5～3.0％加入中性蛋白酶，酶解3.5～4.5h；酶解液置于沸水中10min滅酶活；調節混合液溫度至50～55℃，ph值至9.0～9.5，按照烏賊皮粉末質量的1.0～1.5％加入堿性蛋白酶，酶解4～5h；酶解液置于沸水中10min滅酶活，得烏賊皮酶解液。
6、(3)烏賊皮酶解液的超濾分級：將烏賊皮酶解液采用1kda和3kda超濾膜進行超濾處理，分別收集分子量大于3kd、1-3kda和小于1kda的組分，測定各組分的血管緊張素轉化酶(ace)抑制活性，最高ace抑制活性組分即為超濾酶解液，凍干，得超濾酶解物.
7、(4)烏賊皮降壓肽的分離純化：將超濾酶解物依次經大孔吸附樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(rp-hplc)純化，得高活性烏賊皮降壓肽.
8、進一步地，本申請中烏賊為曼氏無針烏賊(sepiella?maindroni?derochebrune)。
9、進一步地，步驟(1)中的超聲輔助脫脂的工藝參數為：超聲功率180-200w、超聲溫度30-35min、超聲時間30～35分鐘。
10、進一步地，步驟(4)中的大孔吸附樹脂純化、凝膠柱層析和rp-hplc純化為：
11、大孔吸附樹脂純化：將烏賊皮超濾酶解物配成10～15mg/ml的溶液，加入到ab-8型大孔吸附樹脂柱，靜置吸附2.0～2.5h；然后用4～5倍柱體積的超純水洗脫除去未吸附成分，再用4-5被柱體積的95％乙醇溶液洗脫，流速1.0～1.5ml/min，收集洗脫溶液，干燥，即為烏賊皮大孔吸附樹脂層析酶解物；
12、凝膠柱層析：將上述烏賊皮大孔樹脂層析酶解物配成35～45μg/ml溶液，經過sephadex?g-15柱層析分離，用超純水進行洗脫，根據215nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，測定洗脫組分的ace抑制活性；其中，具有最高ace抑制活性的組分為凝膠層析酶解物，凍干；
13、rp-hplc純化：將上述烏賊皮凝膠層析酶解物用雙蒸水配成20～25μg/ml的溶液，利用rp-hplc進行純化，根據制備寡肽的ace抑制活性得1個高活性七肽asp-gly-cys-met-gly-pro-trp(dgcmgpw)，esi-ms測定分子量為764.9da。
14、進一步地，rp-hplc條件為：進樣量8～10μl；色譜柱xterra?ms?c18液相色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動相：55％乙腈；洗脫速度0.8～1.2ml/min；紫外檢測波長215nm。
15、本專利技術一種源于烏賊皮的降血壓寡肽在作為血管緊張素轉化酶抑制劑中的應用。
16、進一步地，該寡肽對ace具有顯著的抑制作用，在1.0mg/ml濃度下對ace的抑制率為73.59±3.16％。
17、本專利技術asp-gly-cys-met-gly-pro-trp(dgcmgpw)對人臍靜脈內皮細胞(huvec)無明顯毒性，且能促進huvec細胞中內源性舒張因子一氧化氮(no)的釋放和抑制內源性收縮因子內皮素-1(et-1)的生成。分子對接實驗結果表明dgcmgpw可與ace氨基酸殘基arg124、tyr62、asn66、asn70、tyr360、asp358、arg402、tyr394、glu143形成氫鍵；與trp357、ala356、his410、his387通過靜電力作用，從而抑制ace的活性。因此，asp-gly-cys-met-gly-pro-trp(dgcmgpw)通過抑制ace的活性顯示一定的降壓功效，且對huvec細胞具有顯著的保護功能，可應用于治療高血壓相關的藥物或者輔助治療產品。
18、本專利技術采用的是一種可控且對環境無污染的生物酶解工藝，利用蛋白酶對烏賊皮的酶解過程進行有效控制，使烏賊皮ace抑制肽最大程度地釋放。所制備的ace抑制肽是利用食源材料烏賊皮經中性蛋白酶和堿性本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.?一種源于烏賊皮的降血壓寡肽，其特征在于，該寡肽的氨基酸序列為Asp-Gly-Cys-Met-Gly-Pro-Trp，ESI-MS測定分子量為764.9?Da。
2.權利要求1所述的一種源于烏賊皮的降血壓寡肽在作為血管緊張素轉化酶抑制劑中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述寡肽作為抑制劑的濃度為1.0?mg/mL。
4.權利要求1所述的一種源于烏賊皮的降血壓寡肽在制備治療高血壓相關藥物或輔助治療產品中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，該寡肽具有促進HUVEC細胞中內源性舒張因子一氧化氮（NO）的釋放和抑制內源性收縮因子內皮素-1（ET-1）的生成。
【技術特征摘要】
1.?一種源于烏賊皮的降血壓寡肽，其特征在于，該寡肽的氨基酸序列為asp-gly-cys-met-gly-pro-trp，esi-ms測定分子量為764.9?da。
2.權利要求1所述的一種源于烏賊皮的降血壓寡肽在作為血管緊張素轉化酶抑制劑中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述...
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