【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于酶工程，尤其涉及一種bap4h突變體及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、脯氨酸羥基化是膠原蛋白中最普遍的翻譯后修飾。由此產(chǎn)生的產(chǎn)物反式-4-羥脯氨酸(hyp)對(duì)膠原蛋白的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要，有研究表明膠原蛋白中脯氨酸羥基化的缺乏會(huì)使三螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而影響與整合素的結(jié)合。4-脯氨酸羥化酶(prolyl?4-hydroxylases，p4hs)是一類依賴于亞鐵離子和2-酮戊二酸的氧化酶，可催化hyp形成。來自炭疽桿菌(bacillus?anthracis)的p4h(bap4h)，可修飾膠原蛋白樣富含脯氨酸的肽。
2、膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)中含有豐富的高度重復(fù)的三肽基序：gly-x-y，其中x和y位置常為脯氨酸和羥脯氨酸。在體內(nèi)，x位置上的脯氨酸需要進(jìn)行羥基化修飾生成4-羥脯氨酸(4-hydroxyproline)，形成穩(wěn)定的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)。
3、目前，膠原蛋白基因和p4hs基因在酵母中共表達(dá)取得了一定的進(jìn)展，以實(shí)現(xiàn)在工業(yè)化的表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生羥基化修飾的膠原蛋白。但野生型p4hs存在表達(dá)量低，對(duì)膠原蛋白的羥化效率較低，羥化后的重組膠原蛋白穩(wěn)定性未改善等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決上述問題，本專利技術(shù)提供了bap4h突變體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所述突變體能高效羥化重組膠原蛋白，增強(qiáng)了重組膠原蛋白的穩(wěn)定性。
2、本專利技術(shù)的第一個(gè)目的是提供一種bap4h突變體，是在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上進(jìn)行突變，包含缺失與取代。
<...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種BaP4H突變體，其中所述突變體能高效羥化重組膠原蛋白，在對(duì)應(yīng)于如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含修飾，該位置選自SEQ?ID?NO.1的多肽的位置3、4、5、7、8、9、10、11、12、14、15、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35、37、38、40、41、44、45、46、48、49、50、51、52、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、76、77、78、79、81、82、83、84、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、121、125、126、127、129、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、150、151、152、154、155、156、157、158、159、1
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變變體，其中所述改變是取代，其中針對(duì)不同的氨基酸殘基所述在一個(gè)位置處的天然存在的氨基酸殘基的取代產(chǎn)生了BaP4H突變體，該變變體與重組膠原蛋白共表達(dá)，可以有效提高其羥化率及穩(wěn)定性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變變體，其中所述改變是缺失，其中針對(duì)不同的氨基酸殘基所述在一個(gè)位置處的天然存在的氨基酸殘基的缺失產(chǎn)生了BaP4H突變體，該變變體與重組膠原蛋白共表達(dá)，可以有效提高其羥化率及穩(wěn)定性。
4.權(quán)利要求1所述的BaP4H突變體，其特征在于，所述修飾的位置及其突變前后氨基酸選自以下任一項(xiàng)：由以下組成的組：N3S、N4S、N5S、I7M、G8N、E9R、N10E、K11I、E12K、T14E、I15R、D17A、H18D、K19D、G20E、N21S、I23H、K24T、T25A、E26R、D27缺失、R28K、E29A、I30F、I32缺失、I33缺失、S34E、K35G、E37S、E38N、L40M、I41P、L44Y、G45Y、N46A、L48S、S49E、D50A、E51W、E52缺失、D54A、E55V、L56N、I57K、E58W、L59Q、S60A、K61缺失、S62E、K63L、L64T、A65N、R66P、S67A、K68A、G70T、S71L、S72缺失、R73T、D74A、N76S、D77P、I78A、R79A、R79T、R79S、R79L、S81L、S82缺失、G83N、A84T、L86K、D87K、D88V、N89E、E90S、L91V、T92M、A93D、K94L、I95V、E96M、K97Q、R98S、I99D、S100缺失、S101A、I102A、N104Q、A107T、S108K、H109L、G110S、E111M、G112A、L113A、H114D、I115E、L116缺失、N117S、E119K、D121G、K125Y、A126W、H127L、D129K、A132Q、E133V、H134T、H134D、H134S、H134K、S135N、R136E、S137M、A138N、A139R、N140S、N141E、R142E、I143S、S144V、T145D、L146K、L150Y、N151Q、D152G、E154A、E155S、G156N、G157M、E158A、T159D、K163S、L164V、N165W、L166Q、S167H、H169I、R171I、K172A、G173R、A175T、E179P、D184W、S186F、L187K、N188A、E189V、L190I、T191P、L192G、H193A、G194M、G195缺失、A196C、T199S、K200V、G201M、E202Q、I205V、A206K、T207S、R211A、R212Y、G213P、T214Q和E217N以及其組合。
5.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種bap4h突變體，其中所述突變體能高效羥化重組膠原蛋白，在對(duì)應(yīng)于如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含修飾，該位置選自seq?id?no.1的多肽的位置3、4、5、7、8、9、10、11、12、14、15、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35、37、38、40、41、44、45、46、48、49、50、51、52、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、76、77、78、79、81、82、83、84、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、119、121、125、126、127、129、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、150、151、152、154、155、156、157、158、159、163、164、165、166、167、169、171、172、173、175、179、184、186、187、188、189、190、191、192、193、194、196、199、200、201、202、205、206、207、211、212、213、214和217，其中各修飾獨(dú)立地為取代或缺失，其中所述變體與seq?id?no.1的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變變體，其中所述改變是取代，其中針對(duì)不同的氨基酸殘基所述在一個(gè)位置處的天然存在的氨基酸殘基的取代產(chǎn)生了bap4h突變體，該變變體與重組膠原蛋白共表達(dá)，可以有效提高其羥化率及穩(wěn)定性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變變體，其中所述改變是缺失，其中針對(duì)不同的氨基酸殘基所述在一個(gè)位置處的天然存在的氨基酸殘基的缺失產(chǎn)生了bap4h突變體，該變變體與重組膠原蛋白共表達(dá)，可以有效提高其羥化率及穩(wěn)定性。
4.權(quán)利要求1所述的bap4h突變體，其特征在于，所述修飾的位置及其突變前后氨基酸選自以下任一項(xiàng)：由以下組成的組：n3s、n4s、n5s、i7m、g8n、e9r、n10e、k11i、e12k、t14e、i15r、d17a、h18d、k19d、g20e、n21s、i23h、k24t、t25a、e26r、d27缺失、r28k、e29a、i30f、i32缺失、i33缺失、s34e、k35g、e37s、e38n、l40m、i41p、l44y、g45y、n46a、l48s、s49e、d50a、e51w、e52缺失、d54a、e55v、l56n、i57k、...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊濟(jì)霖，申家東，張春莉，王碩，安群，林水永，張曦，張影，葛建敬，班甲，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：東莞恒醫(yī)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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