【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種米曲霉工程菌、構(gòu)建方法及用大米生產(chǎn)靈芝酸前體hldo和靈芝酸hldoa的應(yīng)用和方法。
技術(shù)介紹
1、靈芝酸是靈芝中的主要活性成分，是一類高度氧化的羊毛甾烷型四環(huán)三萜類次級代謝產(chǎn)物，具有降血壓、降血脂、護肝、抗氧化、抗癌等多種生物學(xué)功能，是開發(fā)抗癌藥物的重要先導(dǎo)性化合物。
2、靈芝酸hldoa(3-hydroxy-lanosta-8,24-dien-26-oic?acid)是在羊毛甾醇的基礎(chǔ)上，首先經(jīng)過氧化生成hldo(3-hydroxy-lanosta-8,24-dien-26-ol)，隨后通過進一步修飾生成靈芝酸hldoa。由于靈芝酸hldoa也屬于靈芝中抗腫瘤的三萜化合物，是合成其他具有顯著抗腫瘤活性的靈芝酸的關(guān)鍵前體。已有研究報道，在靈芝酸hldoa的基礎(chǔ)上，經(jīng)過p450進一步的氧化修飾生成化合物dhldoa以及ii型靈芝酸，這些化合物都顯示出一定的抗腫瘤活性。因此，hldo和hldoa作為前體物質(zhì)，在其他后修飾基因的作用下，能夠生成更多具有優(yōu)異抗腫瘤活性的靈芝酸，在藥物研發(fā)和靈芝酸生物合成機制過程的研究中，具有十分重要的地位和作用。
3、靈芝酸hldoa和靈芝酸前體hldo的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
4、
5、目前，靈芝酸前體hldo和靈芝酸hldoa的生產(chǎn)主要通過在釀酒酵母中進行異源合成，利用酵母進行異源合成生產(chǎn)hldo和hldoa時，所用發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母缺陷型培養(yǎng)基，可能面臨培養(yǎng)基來源窄、產(chǎn)量不高等問題。
技術(shù)
1、針對靈芝酸前體hldo和靈芝酸hldoa的制備方法存在收率低等問題，本專利技術(shù)的目的在前期構(gòu)建的羊毛甾醇米曲霉工程菌基礎(chǔ)上提供一種可用大米生產(chǎn)靈芝酸前體hldo和靈芝酸hldoa的米曲霉工程菌，以大米為培養(yǎng)基原料高效發(fā)酵制備hldo和hldoa，產(chǎn)量分別可以達到130mg/1kg大米和400mg/1kg大米。
2、概括地，本專利技術(shù)提供了以下方面的技術(shù)方案：
3、第一方面，一種米曲霉(aspergillus?oryzae)工程菌。
4、所述的米曲霉工程菌中包括表達質(zhì)粒1，
5、所述的表達質(zhì)粒1上包括表達靈芝細胞色素p450氧化酶的基因片段1和表達靈芝細胞色素p450還原酶的基因片段2；
6、所述的靈芝細胞色素p450氧化酶具有如seq?id?no.7所示的氨基酸序列或其功能變體；
7、所述的靈芝細胞色素p450還原酶具有如seq?id?no.8所示的氨基酸序列或其功能變體；
8、所述的功能變體與seq?id?no.7或seq?id?no.8具有相同生物學(xué)功能。
9、seq?id?no.7：
10、mpdsslvlvaiagaayifwlvfhrylvrspldnlpsppsspflgnlpdiihrqs
11、hlwwrhvsntygpatkltaffgiqmlytfdpkamysilvkdtelypkktaay
12、ddftlfigpgllfaegaqhrrqrkwlnpvfsvaqlrdvshvfygvaykleeai
13、rnrvgaqsqnldvngwmarttlemlgqaglgysfdkftedstdsygealks
14、ffpvinhvpllnlfvmtlanhipkwlmrrvlrlavpfphvlrllrisetmqkr
15、sseiiqqkktalqkgdkalihqvgegkdimsvllksnmnapsdseklpdeell
16、aqmstfilagmdttsnalsrilhllaehpdvqeklrhelseareivgngkdvp
17、yddlvklpyldavcretlrlhpplnligrraakdmvvplsspvrgrdgtlvn
18、evtlpkdtfvllglqacntnkklwgedayewkperwlqplpsmleearvpg
19、vysnlmsfsggvrscigfkfsqlemkvlltillpafsfeltekpifwntsavsyp
20、tmdkdstrpemllkvkalac
21、seq?id?no.8：
22、mastdtvilalgivlaavylfrdqlfaaskpnsvpvssskanvgggnprdfi
23、akmkegkkrivifygsqtgtaeeyairlakeakqkfglaslvcdpeeydfenl
24、dqisddscvffvmatygegeptdnavtlcqnlsddsfefsngehklsglkyv
25、vfglgnktyehynlisrnvdadltkmgairigergegdddksmeedylewk
26、dgmweefsrvmgveegqggdspdfvvtevadhpaekvylgelsaraltrsk
27、gihdaknpypapitvarelfaegadrncihaeldtensgityqhgdhvgvwps
28、nseveverllctlglhdkkdtviqiesldpalakvpfpvpttyvtvlrhyidis
29、avagrqilgvlskfapnpeaeaflknlntnkeeynnvvnhgclklaeilqla
30、ardsisvsptpenttswkipfdiivssiprlqpryysissspklhphsihvtcvvlk
31、yesvknervdtrwvfgtgsnfllnlkyaangeevplletkeeparvlppyyai
32、egprgaykqetiykvpihvrrstfrlptnpkspvimigpgtgvapfrgfvqerv
33、amarrtiekngpegladwgsirlyfgsrtstqdflykdewpeygkelhgkft
34、lrcafsrevyaadgskiyvqdllwedretvadailngkgyvyicgdarsmskaveetlcrilgeakggsaevegaaelkllkersrfltdvws。
35、所述的米曲霉工程菌出發(fā)菌株為cgmcc?no.3.95，所述的米曲霉工程菌中還包括表達hmgr和glls的pra質(zhì)粒。
36、所述的表達質(zhì)粒的基礎(chǔ)質(zhì)粒為pua。
37、所述的基因片段1為cyp5150l8，所述的基因片段2為iglcpr；所述的cyp5150l8的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述的iglcpr核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
38、第二方面，本專利技術(shù)提供了前述的米曲霉工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
39、(1)表達質(zhì)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種米曲霉(Aspergillus?oryzae)工程菌，其特征在于，所述的米曲霉工程菌中包括表達質(zhì)粒1，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的米曲霉工程菌，其特征在于，所述的米曲霉工程菌出發(fā)菌株為CGMCC?NO.3.95，所述的米曲霉工程菌中還包括表達HMGR和GLLS的pRA質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的米曲霉工程菌，其特征在于，所述的表達質(zhì)粒的基礎(chǔ)質(zhì)粒為pUA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的米曲霉工程菌，其特征在于，所述的基因片段1為CYP5150L8，所述的基因片段2為iGLCPR；所述的CYP5150L8的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述的iGLCPR核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的米曲霉工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的步驟(1-1)中，擴增所用的引物具有如SEQ?ID?NO.3-4所示的核苷酸序列；所述的步驟(1-3)中，擴增所用的引物具有如SEQID?NO.5-6所示的核苷酸序列。
7.
8.權(quán)利要求1-4任一項所述的米曲霉工程菌在生產(chǎn)HLDO和HLDOA中的應(yīng)用。
9.一種生產(chǎn)HLDO和HLDOA的方法，其特征在于，包括使用權(quán)利要求1-4任一項所述的米曲霉工程菌進行發(fā)酵。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于，所述的米曲霉工程菌的發(fā)酵底物為大米。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種米曲霉(aspergillus?oryzae)工程菌，其特征在于，所述的米曲霉工程菌中包括表達質(zhì)粒1，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的米曲霉工程菌，其特征在于，所述的米曲霉工程菌出發(fā)菌株為cgmcc?no.3.95，所述的米曲霉工程菌中還包括表達hmgr和glls的pra質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的米曲霉工程菌，其特征在于，所述的表達質(zhì)粒的基礎(chǔ)質(zhì)粒為pua。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的米曲霉工程菌，其特征在于，所述的基因片段1為cyp5150l8，所述的基因片段2為iglcpr；所述的cyp5150l8的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述的iglcpr核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的米曲霉工程菌的構(gòu)建方法...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李振皓，彭爽，李明焱，李振宇，徐靖，劉成偉，熊暉，
申請(專利權(quán))人：浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。