【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及類器官領域，具體涉及一種nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法。
技術介紹
1、nk細胞又稱自然殺傷細胞(natural?killer?cell，nk細胞)，是機體內重要的免疫細胞。nk細胞是體內負責殺傷老化、受病毒感染、腫瘤等異常細胞的最主要“戰士”。nk細胞與人體其他150多種白細胞不同，不需要接受免疫系統的特殊指令，也不需要其他細胞配合，自己單獨就能識別和攻擊外來細胞、癌細胞和病毒感染的細胞。循環的nk細胞通常處于休眠狀態，一旦被激活，它們會滲透到組織中，分泌穿孔素及腫瘤壞死因子，攻擊腫瘤細胞和病毒感染細胞。
2、nk細胞作為抗腫瘤免疫的重要細胞之一，其對腫瘤的殺傷能力需要在體外建立有效的評估體系。腫瘤類器官是腫瘤學研究中最具臨床相關性的體外模型之一，是評估nk細胞的殺傷能力的絕佳幫手。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的之一在于提供一種nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法。
2、為達到上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、1、一種nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，取腫瘤類器官用tryple消化酶進行消化傳代，傳代后與懸浮培養過夜，然后按照效靶比100：1～300：1將nk細胞與腫瘤類器官混合，然后加入共培養培養基共培養至少4h，通過annexin?v-fitc/pi染色觀察類器官完整形態或采用celltoxtmgreen?cytotoxicity?assay定量檢測分析殺傷效果。p>
4、本專利技術優選的，所述腫瘤類器官為4t1-luc細胞系荷瘤小鼠的腫瘤組織來源的乳腺癌類器官或mc38細胞系荷瘤小鼠的腫瘤組織來源的結直腸癌類器官。
5、本專利技術優選的，所述共培養培養基以腫瘤類器官培養基為母液，添加il2和基質膠，至il2終濃度為200iu/ml，基質膠的體積分數為5％。
6、本專利技術優選的，所述乳腺癌類器官的類器官培養基各組分質量比如下：10mmhepes，1％glutamax，1％青霉素-鏈霉素，500nm?a83-01，1％b27?supplement，10μm?y-27632，1.56mm?n-acetylcysteine，10mm?nicotinamide，10ng/ml?fgf10，10μm?forskolin，300ng/ml?wnt-3a，500ng/ml?r-spondin1，30ng/ml?noggin，其余為基礎培養基advanceddmem-f12；
7、所述結直腸癌類器官各組分終濃度質量比如下：10mm?hepes，1％?glutamax，1％青霉素-鏈霉素，1％?n2，2％?b27?supplement，500nm?a83-01，10μm?y-27632，1mm?n-acetylcysteine，50ng/ml?wnt-3a，500ng/ml?r-spondin1，50ng/ml?noggin，50ng/ml?egf，10nm?gastrin?i，10um?sb202190，10um?dexamethasone其余為基礎培養基advanced?dmem-f12。
8、本專利技術優選的，所述annexin?v-fitc/pi染色是將annexin?v-fitc和pi工作液用dpbs按照annexin?v-fitc：dpbs體積比為1：10，pi：dpbs體積比為1:8稀釋。
9、本專利技術優選的，所述celltoxtmgreen?cytotoxicity?assay定量檢測分析是celltoxtmgreen?cytotoxicity?assay試劑盒融解后，取assay?buffer和celltoxtmgreendye按體積比為200:1混合制成凋亡檢測工作液，然后向檢測孔中加入凋亡檢測工作液，室溫避光孵育15min，酶標儀檢測ex/em＝490/525nm處的熒光強度。
10、本專利技術優選的，所述nk細胞脾臟分離得到。
11、本專利技術優選的，所述nk細胞培養基包括nk細胞起始培養基和nk細胞擴增培養基；
12、所述nk細胞起始培養基各配方如下：0.1mmβ-me，10％滅活fbs，1％三抗，1％sodium?pyruvate，1％濃度為100mm?neaa，25mm?hepes，50×b27，1000iu/ml?il-2，100ng/ml?il-15，10ng/ml?il-21，余量為基礎培養基rpmi?1640；
13、所述nk細胞擴增培養基各配方如下：0.1mmβ-me，10％滅活fbs，1％三抗，1％sodium?pyruvate，1％濃度為100mm?neaa，25mm?hepes，50×b27，3000iu/ml?il-2，600ng/ml?il-15，60ng/ml?il-21，余量為基礎培養基rpmi?1640。
14、本專利技術的有益效果在于：本專利技術提供了一種nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，通過將nk細胞與腫瘤類器官共培養作為臨床研究的重要建模工具，可以幫助我們深入了解對nk與腫瘤殺傷作用，為深度研究免疫細胞殺傷腫瘤機制奠定可靠基礎。本研究以小鼠模型為著力點，分離荷瘤小鼠的腫瘤與脾臟，腫瘤組織培養成為類器官，同時培養、擴增脾臟來源nk，將激活后的nk與腫瘤類器官(乳腺癌類器官、結直腸癌類器官)共培養，建立nk與腫瘤類器官的共培養模型，填補之前nk細胞培養方法、nk與腫瘤類器官共培養方法為零的空缺，為后續商業化樣本的nk與腫瘤類器官共培養奠定基礎。
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1.一種NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：取腫瘤類器官用TryplE消化酶進行消化傳代，傳代后與懸浮培養過夜，然后按照效靶比100：1～300：1將NK細胞與腫瘤類器官混合，然后加入共培養培養基共培養至少4h，通過Annexin?V-FITC/PI染色觀察類器官完整形態或采用CellToxTMGreen?Cytotoxicity?Assay定量檢測分析殺傷效果。
2.根據權利要求1所述NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述腫瘤類器官為4T1-Luc細胞系荷瘤小鼠的腫瘤組織來源的乳腺癌類器官或MC38細胞系荷瘤小鼠的腫瘤組織來源的結直腸癌類器官。
3.根據權利要求1所述NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述共培養培養基以腫瘤類器官培養基為母液，添加IL2和基質膠，至IL2終濃度為200IU/ml，基質膠的體積分數為5％。
4.根據權利要求2所述NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述乳腺癌類器官的類器官培養基各組分質量比如下：10mM?HEPES，1％G
5.根據權利要求1所述NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述Annexin?V-FITC/PI染色是將Annexin?V-FITC和PI工作液用DPBS按照Annexin?V-FITC：DPBS體積比為1：10，PI：DPBS體積比為1:8稀釋。
6.根據權利要求1所述NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述CellToxTMGreen?Cytotoxicity?Assay定量檢測分析是CellToxTMGreen?CytotoxicityAssay試劑盒融解后，取Assay?Buffer和CellToxTMGreen?Dye按體積比為200:1混合制成凋亡檢測工作液，然后向檢測孔中加入凋亡檢測工作液，室溫避光孵育15min，酶標儀檢測Ex/Em＝490/525nm處的熒光強度。
7.權利要求1所述NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述NK細胞脾臟分離得到。
8.權利要求1所述NK細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述NK細胞培養基包括NK細胞起始培養基和NK細胞擴增培養基；
...【技術特征摘要】
1.一種nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：取腫瘤類器官用tryple消化酶進行消化傳代，傳代后與懸浮培養過夜，然后按照效靶比100：1～300：1將nk細胞與腫瘤類器官混合，然后加入共培養培養基共培養至少4h，通過annexin?v-fitc/pi染色觀察類器官完整形態或采用celltoxtmgreen?cytotoxicity?assay定量檢測分析殺傷效果。
2.根據權利要求1所述nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述腫瘤類器官為4t1-luc細胞系荷瘤小鼠的腫瘤組織來源的乳腺癌類器官或mc38細胞系荷瘤小鼠的腫瘤組織來源的結直腸癌類器官。
3.根據權利要求1所述nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述共培養培養基以腫瘤類器官培養基為母液，添加il2和基質膠，至il2終濃度為200iu/ml，基質膠的體積分數為5％。
4.根據權利要求2所述nk細胞與腫瘤類器官共培養評價殺傷效果的方法，其特征在于：所述乳腺癌類器官的類器官培養基各組分質量比如下：10mm?hepes，1％glutamax，1％青霉素-鏈霉素，500nm?a83-01，1％b27?supplement，10μm?y-27632，1.56mm?n-acetylcysteine，10mm?nicotinamide，10ng/ml?fg...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉海洋，于升，蘇芮，何曉燕，米小容，闞方明，黃璘，
申請(專利權)人：北京嘉士騰醫學檢驗實驗室有限公司，
類型：發明
國別省市：
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