一種檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白１ｇＧ含量的試劑盒及預(yù)包被酶標(biāo)板的制備方法，它涉及了一種檢測(cè)牛乳免疫球蛋白含量的試劑盒及預(yù)包被酶標(biāo)板的制備方法。它解決了現(xiàn)有檢測(cè)手段中存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和精確性差或?qū)υO(shè)備和操作人員的要求極高造成普及困難的缺陷。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒是由免疫球蛋白１ｇＧ標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛ＩｇＧ抗體、稀釋液、洗滌液、反應(yīng)終止液和顯色液制成。本發(fā)明專利技術(shù)的預(yù)包被酶標(biāo)板按照以下方法制備：一、稀釋抗體，包被；二、加入緩沖液，孵育；三、冷凍干燥；即得到制備好的預(yù)包被酶標(biāo)板。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒和制備的酶標(biāo)板配合使用具有使用方便，對(duì)操作人員沒(méi)有特殊要求，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測(cè)牛乳球蛋白含量的試劑盒及預(yù)包被酶標(biāo)板的制備方法。
技術(shù)介紹
免疫球蛋白G (IgG)作為牛初乳中一種非常重要的免疫因子，其含量的 多少是衡量牛初乳及其產(chǎn)品優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。IgG也是免疫乳及其制品的 主要功能成分，其含量是免疫乳及其制品質(zhì)量好壞的最重要標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)牛乳IgG 的檢測(cè)還可以評(píng)估常乳中是否摻有牛初乳以及判斷牛乳是否摻假。因而，牛乳 IgG的檢測(cè)對(duì)于乳制品的質(zhì)量控制有著非常重要的意義。目前檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白lgG的手段主要有以下幾類 一、免疫單向擴(kuò) 散、免疫雙向擴(kuò)散以及火箭免疫電泳，這些方法具有操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低的 優(yōu)點(diǎn)，但存在著檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、精確性差的缺點(diǎn)；二、膠體金免疫層析技術(shù)雖然 可以快速檢測(cè)，但只局限于定性或半定量檢測(cè)，無(wú)法達(dá)到精確檢測(cè)的目的；三、 高效液相和毛細(xì)管電泳雖然能夠快速、精確檢測(cè)，但對(duì)設(shè)備和操作人員的要求 極高，不適合常規(guī)工廠和普通試驗(yàn)室分析，普及困難。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)是為了解決現(xiàn)有檢測(cè)手段中存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和精確性差或?qū)υO(shè)備 和操作人員的要求極高造成普及困難的缺陷，而提供一種檢測(cè)牛乳中免疫球蛋 白lgG含量的試劑盒及預(yù)包被酶標(biāo)板的制備方法。本專利技術(shù)檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白lgG含量的試劑盒是由10嗎的牛免疫球蛋 白lgG、 1.0mL的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體稀釋液、50mL的稀 釋液、50mL洗滌液、10mL的反應(yīng)終止液和20mL的顯色液制成；其中辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體稀釋液是將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛 IgG抗體用pH值為8.0的Tris緩沖液稀釋至9000~11000倍；稀釋液為pH值 為8.0的Tris緩沖液；洗滌液為Tween20質(zhì)量濃度為0.05%、 pH值為8.0的 Tris緩沖液；反應(yīng)終止液為濃度為2mol/L的硫酸；顯色液按照體積份數(shù)由20份的pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、1份的DMSO濃度為2g/L的 TMB溶液和0.064份的質(zhì)量濃度為0.75%的11202水溶液組成。本專利技術(shù)檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預(yù)包被酶標(biāo)板按照以下方法制 備 一、用戊二醛質(zhì)量濃度為0.8%、 pH值為9.6的Tris緩沖液將兔抗牛IgG 抗體稀釋400 500倍，向酶標(biāo)板上各孔加入兔抗牛IgG抗體稀釋液10(^L，再 將加入抗體稀釋液后的酶標(biāo)板在37'C的條件下孵育2h或在4"C的條件下用包 被液進(jìn)行包被8 16小時(shí)，再將酶標(biāo)板各孔洗滌3次；二、向步驟一洗滌后的 酶標(biāo)板各孔加入含有明膠質(zhì)量濃度為1°/。、 pH值為8.0的Tris緩沖液200pL， 在37。C的條件下孵育lh后再洗滌3次；三、向步驟二洗滌后的酶標(biāo)板在-20。C 的條件下保溫lh后，再在-2(TO-4(TC的條件下真空冷凍干燥8 10h;即得到 預(yù)包被酶標(biāo)板；其中步驟一和步驟二的洗滌為向酶標(biāo)板上各孔加入250^L Tween20質(zhì)量濃度為0.05%、 pH值為8.0的Tris緩沖液，靜置3分鐘后，再將 孔內(nèi)的溶液吸盡。本專利技術(shù)的試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)1、簡(jiǎn)化了酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白lgG過(guò)程的操作步驟， 縮短了檢測(cè)時(shí)間，單次檢測(cè)時(shí)間僅需3 4小時(shí)，而免疫單向擴(kuò)散法和火箭免疫 電泳法的檢測(cè)時(shí)間通常需要至少8小時(shí)和24小時(shí)，同時(shí)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果靈 敏度可達(dá)到ng級(jí)；2、試劑盒的檢測(cè)范圍在100~1000ng/mL之間，試劑盒的 檢測(cè)靈敏度達(dá)30ng/mL，在檢測(cè)時(shí)組內(nèi)變異系數(shù)為1.86%~4.22%，組間變異系 數(shù)為3.82% 9.86%，回收率為98.07%~105.36%，具有很好的可重復(fù)性和可靠 性；3、操作人員不需要特殊培訓(xùn)，易于普及。本專利技術(shù)制備的預(yù)包被酶標(biāo)板具有以下優(yōu)點(diǎn)本專利技術(shù)的酶標(biāo)板縮短免疫吸附法檢測(cè)免疫球蛋白lgG的檢測(cè)時(shí)間，可在3 4小時(shí)完成檢測(cè)分析，簡(jiǎn)化了操作，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性；將本專利技術(shù)制備的預(yù)包被酶標(biāo)板和本專利技術(shù)的試劑盒配合使用檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白lgG含量，使用方便，對(duì)操作人員沒(méi)有特殊要求，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)費(fèi)用低，單次檢測(cè)成本為5元左右。 具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方4式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白lgG含量的試劑盒是由10叱的牛免疫球蛋白lgG、 l.OmL的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗 體稀釋液、50mL的稀釋液、50mL洗滌液、10mL的反應(yīng)終止液和20mL的顯 色液制成；其中辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體稀釋液是將辣根過(guò)氧化 物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體用pH值為8.0的Tris緩沖液稀釋至9000 11000 倍；稀釋液為pH值為8.0的Tris緩沖液；洗滌液為Tween20質(zhì)量濃度為0.05%、 pH值為8.0的Tris緩沖液；反應(yīng)終止液為濃度為2mol/L的硫酸；顯色液按照 體積份數(shù)由20份的pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、1份的DMSO 濃度為2g/L的TMB溶液和0.064份的質(zhì)量濃度為0.75%的11202水溶液組成。本實(shí)施方式的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體購(gòu)于美國(guó) sigma畫aldrich公司。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)為辣根過(guò)氧化 物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體稀釋液是將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體 用pH值為8.0的Tris緩沖液稀釋至10000倍。其它與具體實(shí)施方式一相同。用本實(shí)施方式的試劑盒測(cè)定牛乳中免疫球蛋白lgG含量的方法按如下步 驟進(jìn)行 一、樣品處理取待測(cè)液態(tài)乳樣在6'C、離心速度為5000r/min的條 件下離心30min，取10mL的下層脫脂乳樣，用雙蒸水稀釋至1000mL，再?gòu)?稀釋后的溶液中取10mL溶液，再用雙蒸水稀釋至1000mL，混勻后從再次稀 釋后的溶液中取100pL樣品溶液，用pH8.0 Tris緩沖液稀釋至lmL，得到處理 好的樣品；二、抗原添加取預(yù)包被好的酶標(biāo)板，以其中一孔不加任何溶液作 為空白對(duì)照孔，以另一孔加入100pL、 pH8.0 Tris緩沖液作為陰性對(duì)照孔，將 濃度為100ng/mL、 125ng/mL、 250ng/mL、 500ng/mL、 750ng/mL和1000ng/mL 的IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入酶標(biāo)板中，每個(gè)孔的IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量為100^， 再將步驟一處理好的樣品溶液加入酶標(biāo)板的其余各孔，每個(gè)孔的加入量為 lOO(iL，然后在37。C的條件下孵育lh，再洗滌5次；三、酶標(biāo)抗體添加酶 標(biāo)抗體采用10000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體，每孔加入 酶標(biāo)抗體100pL，空白對(duì)照孔不加酶標(biāo)抗體，在37。C的條件下孵育lh，然后 洗滌5次；四、添加酶促反應(yīng)底物向酶標(biāo)板各孔添加顯色液100pL，在37"C5的條件下孵育8 12min;五、加終止液待標(biāo)準(zhǔn)品的100ng/mL、 125ng/mL和 250ng/mL三孔有明顯的梯度藍(lán)色，并且500ng/mL、 750ng/mL禾B 1000ng/mL 三孔沒(méi)有出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)，每孔加入濃度為2mol/L的H2S04 50pL;六、酶標(biāo)儀檢 測(cè)以空白對(duì)照孔校領(lǐng)，450nm波長(zhǎng)檢測(cè)；七、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以牛IgG標(biāo)準(zhǔn) 品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白１ｇＧ含量的試劑盒，其特征在于檢測(cè)牛乳中免疫球蛋白１ｇＧ含量的試劑盒是由１０μｇ的牛免疫球蛋白１ｇＧ、１．０ｍＬ的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛ＩｇＧ抗體稀釋液、５０ｍＬ的稀釋液、５０ｍＬ洗滌液、１０ｍＬ的反應(yīng)終止液和２０ｍＬ的顯色液制成；其中辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛ＩｇＧ抗體稀釋液是將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛ＩｇＧ抗體用ｐＨ值為８．０的Ｔｒｉｓ緩沖液稀釋至９０００～１１０００倍；稀釋液為ｐＨ值為８．０的Ｔｒｉｓ緩沖液；洗滌液為Ｔｗｅｅｎ２０質(zhì)量濃度為０．０５％、ｐＨ值為８．０的Ｔｒｉｓ緩沖液；反應(yīng)終止液為濃度為２ｍｏｌ／Ｌ的硫酸；顯色液按照體積份數(shù)由２０份的ｐＨ值為５．０的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液、１份的ＤＭＳＯ濃度為２ｇ／Ｌ的ＴＭＢ溶液和０．０６４份的質(zhì)量濃度為０．７５％的Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］水溶液組成。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：霍貴成，姜瞻梅，田波，吳剛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：93[中國(guó)|哈爾濱]
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