【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于職業衛生以及生物，具體涉及一種檢測汽油職業暴露人員呼吸道微生物感染常見細菌的檢測試劑及方法。
技術介紹
1、汽油具有強烈的揮發性，主要以蒸氣的形式經呼吸道入人體，通過體循環到大腦，對神經系統具有毒害作用。長期接觸汽油后會出現皮膚干燥、皸裂，神經功能衰弱或紊亂，頭暈、健忘、失眠、多夢。在交通運輸行業、加油站加氣站等從事勞動的職業人員，容易發生汽油暴露，造成職業傷害。
2、人體體表存在大量的微生物菌群，其定植于皮膚、咽部、呼吸道、胃腸道等部位，這些微生物定植群積累形成一定的微生物生態環境，影響著人體的技能代謝、自身免疫、營養發育等方面。對于長期從事汽油職業的特定職業人員來說，如果防護不到位，或工作環境欠佳，軍容易發生汽油暴露，而汽油職業暴露對人體的其呼吸道、消化道的細菌微生物均存在內在聯系，致使相關職業人員出現煩躁、焦慮等負面情緒，對其工作造成干擾，甚至影響其身體健康，導致神經受損，進一步增加職業暴露的風險。
3、國內外關對于細菌性疾病的檢測和診斷技術種類繁多，主要包括細菌革蘭氏染色、細菌分離培養、生化鑒定、分子生物學檢測技術以及免疫學檢測技術，其中，聚合酶鏈式反應技術因其簡便、快速、高效以及高敏感性和高特異性的特點被廣泛用于細菌的快速檢測。然而，目前關于研究汽油職業暴露人員呼吸道微生物感染的研究并不多見，且均存在一定缺陷，如納入研究的人員數量少，或細菌暴露部位選擇單一，卻并沒有一種覆蓋面全面的汽油職業暴露人員呼吸道感染常見細菌的檢測方法。
技術實現思路>
1、為了克服現有技術的缺點與不足，本專利技術旨在建立一種汽油職業暴露人員呼吸道微生物感染常見細菌的檢測方法，以及制備相應的可用于商業化生產的檢測試劑。
2、為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案包括：
3、一方面，本專利技術提供一組用于檢測汽油職業暴露人員呼吸道微生物感染常見細菌的引物組，所述引物組包括：檢測沙門氏菌、克雷伯菌、不動桿菌、化膿鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、綠膿假單胞菌的引物。
4、所述檢測沙門氏菌的引物包括如seq?id?no.1所示的上游引物序列和如seq?idno.2所示的下游引物序列；
5、所述檢測克雷伯菌的引物包括如seq?id?no.3所示的上游引物序列和如seq?idno.4所示的下游引物序列；
6、所述檢測不動桿菌的引物包括如seq?id?no.5所示的上游引物序列和如seq?idno.6所示的下游引物序列；
7、所述檢測化膿球菌的引物包括如seq?id?no.7所示的上游引物序列和如seq?idno.8所示的下游引物序列；
8、所述檢測凝固酶陰性葡萄球菌的引物包括如seq?id?no.9所示的上游引物序列和如seq?id?no.10所示的下游引物序列；
9、所述檢測綠膿假單胞菌的引物包括如seq?id?no.11所示的上游引物序列和如seqid?no.12所示的下游引物序列。
10、另一方面，本專利技術還提供上述的引物組在制備快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的試劑盒中的應用。
11、另一方面，本專利技術還提供一種快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物組。所述引物組中各上下游引物的工作濃度分別為1～15μmol/l，優選為10μmol/l。
12、進一步地，所述的試劑盒還包括多重pcr緩沖液、taq?dna聚合酶、dntp、超純水。
13、進一步地，所述的試劑盒還包括陰性對照品和/或陽性對照品。
14、進一步地，以含有depc處理的超純水作為陰性對照品，以含有沙門氏菌、克雷伯菌、不動桿菌、化膿鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、綠膿假單胞菌基因序列的重組質粒dna作為陽性對照品。
15、另一方面，本專利技術還提供上述的引物組或試劑盒在快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌中的應用。
16、另一方面，本專利技術還提供一種快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的方法，包括如下步驟：
17、1)提取待測樣本細菌基因組dna；
18、2)以步驟1)獲得的基因組dna為模板，利用上述的引物組，進行多重pcr擴增反應；
19、3)對擴增產物進行電泳檢測并分析結果，通過判斷擴增反應體系中是否得到擴增產物，來判斷檢測樣品中是否含有相應的沙門氏菌、克雷伯菌、不動桿菌、化膿鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、綠膿假單胞菌。
20、進一步地，所述判斷還可以進一步通過產物純化并測序來進行鑒定。
21、進一步地，步驟(2)的多重pcr擴增反應體系為：10×dntp?1μl，10×buffer緩沖液2.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，taqdna聚合酶0.5μl，dna模板1μl，超純水18μl，共25μl。
22、具體的上述的反應體系中，用于擴增沙門氏菌的引物組(seq?id?no.1-2)的上下游引物的體積各為0.15μl、用于擴增克雷伯菌的引物組(seq?id?no.3-4)的上下游引物的體積各為0.15μl、用于擴增不動桿菌的引物組(seq?id?no.5-6)的上下游引物的體積各為0.2μl、用于擴增化膿鏈球菌的引物組(seq?id?no.7-8)的上下游引物的體積各為0.1μl、用于擴增凝固酶陰性葡萄球菌的引物組(seq?id?no.9-10)的上下游引物的體積各為0.2μl、用于擴增綠膿假單胞菌的引物組(seq?id?no.11-12)的上下游引物的體積各為0.2μl。
23、進一步地，步驟(2)的多重pcr擴增反應程序為：預變性溫度95℃，預變性時間5分鐘；變性溫度95℃，時間40秒；退火溫度為55℃，時間35秒；延伸溫度為72℃，時間1分鐘；一共40個循環，最后終延伸溫度是72℃，時間10分鐘。
24、另一方面，本專利技術還提供上述的試劑盒在制備汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的檢測產品中的用途。
25、本專利技術具有以下有益效果：
26、采用本專利技術的試劑盒和檢測方法，可以快速檢測6種汽油職業暴露人員呼吸道感染常見細菌，包括沙門氏菌、克雷伯菌、不動桿菌、化膿鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、綠膿假單胞菌。該方法對上述6種細菌的檢測靈敏度均為0.5copies/μl，并且對大腸埃希菌、志賀氏菌、變形桿菌、耶爾森菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌均未檢出，具有檢測靈敏度高、特異性強的優點。此外，本專利技術通過優化反應體系獲得了具有高效擴增的多重pcr反應體系，經140v電壓以及2.5％瓊脂糖凝膠電泳30分鐘后，即可通過肉眼直接辨別產物大小，得出檢測結果。
27、本專利技術的檢測汽油職業暴露人員呼吸道微生物感染的方法能夠實現快速檢測，從樣本收集到出具檢測結果耗時小于4個小時，相較于傳統的微生物培養檢測法耗時大大縮短。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的引物組，其特征在于，所述的引物組包括用于檢測沙門氏菌、克雷伯菌、不動桿菌、化膿鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、綠膿假單胞菌的引物；所述檢測沙門氏菌的引物序列如SEQ?ID?NO.1-2所示；所述檢測克雷伯菌的引物序列如SEQ?ID?NO.3-4所示；所述檢測不動桿菌的引物序列如SEQ?ID?NO.5-6所示；所述檢測化膿鏈球菌的引物序列如SEQ?ID?NO.7-8所示；所述檢測凝固酶陰性葡萄球菌的引物序列如SEQ?ID?NO.9-10所示；所述檢測綠膿假單胞菌的引物序列如SEQ?ID?NO.11-12所示。
2.權利要求1所述的引物組在制備快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的試劑盒中的應用。
3.一種快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括多重PCR緩沖液、Taq?DNA聚合酶、dNTP、超純水。
5.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陰性對
6.權利要求1所述的引物組或權利要求3所述的試劑盒在快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌中的應用。
7.一種快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)的多重PCR擴增反應體系為：10×dNTP?1μL，10×buffer緩沖液2.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板1μL，超純水18μL，共25μL。
9.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)的多重PCR擴增反應程序為：預變性溫度95℃，預變性時間5分鐘；變性溫度95℃，時間40秒；退火溫度為55℃，時間35秒；延伸溫度為72℃，時間1分鐘；一共40個循環，最后終延伸溫度是72℃，時間10分鐘。
10.權利要求3-5任一項所述的試劑盒在制備汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的檢測產品中的用途。
...【技術特征摘要】
1.一種快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的引物組，其特征在于，所述的引物組包括用于檢測沙門氏菌、克雷伯菌、不動桿菌、化膿鏈球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、綠膿假單胞菌的引物；所述檢測沙門氏菌的引物序列如seq?id?no.1-2所示；所述檢測克雷伯菌的引物序列如seq?id?no.3-4所示；所述檢測不動桿菌的引物序列如seq?id?no.5-6所示；所述檢測化膿鏈球菌的引物序列如seq?id?no.7-8所示；所述檢測凝固酶陰性葡萄球菌的引物序列如seq?id?no.9-10所示；所述檢測綠膿假單胞菌的引物序列如seq?id?no.11-12所示。
2.權利要求1所述的引物組在制備快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的試劑盒中的應用。
3.一種快速檢測汽油職業暴露人員呼吸道感染細菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括多重pcr緩沖液、taq?dna聚合酶、dntp、超純水。
5.根據權利...
【專利技術屬性】
技術研發人員：伍玲燕，潘燦盛，許澤群，林欽恒，黃啟紅，
申請(專利權)人：廣東省科學院測試分析研究所中國廣州分析測試中心，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。