【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種水稻ssiiia突變型蛋白、突變型基因及其應(yīng)用，屬于水稻遺傳育種和富含抗性淀粉作物新資源創(chuàng)新領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
1、水稻是重要的糧食作物，隨著人們生活水平的提高，對優(yōu)質(zhì)水稻品種的需求進一步增大。抗性淀粉(resistant?starch,rs)是指不能被健康人體小腸酶解，但可以在人的結(jié)腸中被發(fā)酵分解的淀粉及其降解物。這種淀粉在體內(nèi)消化速度緩慢，因此攝食富含rs的食物可以維持餐后血糖水平和改善腸道健康，適合超重、肥胖癥和糖尿病患者來食用。而常規(guī)米飯中的rs含量極低，通常低于1％，所以提高米飯中的rs含量是目前功能性稻米培育的主要方向之一。
2、水稻可溶性淀粉合酶iiia(starch?synthase?iiia,ssiiia)負責(zé)支鏈淀粉長分支側(cè)鏈的延長。研究表明ssiiia可以通過調(diào)控淀粉組分、淀粉結(jié)構(gòu)和碳源分配來增加稻米rs含量。目前，國內(nèi)外育種學(xué)家已經(jīng)挖掘了一些ssiiia等位基因，它們都是缺失ssiiia的突變體，但其產(chǎn)生了堊白籽粒，且稻米產(chǎn)量、外觀和蒸煮食味品質(zhì)等較差，限制了其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們生活中的直接應(yīng)用。
3、傳統(tǒng)的育種方式耗時、費力、不確定因素比較多。而近幾年來發(fā)展的基于crispr/cas9的基因單堿基編輯系統(tǒng)，能實現(xiàn)單堿基編輯，避免基因敲除造成突變蛋白生物學(xué)功能喪失導(dǎo)致的極端變異表型，更有利于產(chǎn)生在生產(chǎn)實踐中可利用的變異類型。但是，尚未將相關(guān)技術(shù)用編輯ssiiia基因來提高水稻品質(zhì)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、專利技術(shù)目的：本專利
2、技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種水稻ssiiia突變型蛋白，所述ssiiia突變型蛋白是將野生型ssiiia蛋白的第1697位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼帷⒘涟彼峄虮奖彼岬玫降模凰鲆吧退緎siiia蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。本專利技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)該1697位脯氨酸變?yōu)榘腚装彼帷⒘涟彼峄虮奖彼峥墒沟久拙哂型庥^保持透明、淀粉組分改變和抗性淀粉含量升高的特性。
3、其中，所述水稻ssiiia突變型蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.6～8任一項所示或
4、所述氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有ssiiia活性的由所述水稻ssiiia突變型蛋白衍生的蛋白質(zhì)。
5、本專利技術(shù)還提供了一種編碼所述水稻ssiiia突變型蛋白的突變型基因。所述基因可以包括：在嚴格條件下與編碼上述突變型蛋白的核苷酸序列雜交且編碼具有ssiiia活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
6、其中，其核苷酸序列如seq?id?no.3～5任一項所示，或
7、在嚴格條件下與前述突變型基因限定的核酸序列雜交且編碼具有ssiiia活性蛋白質(zhì)的核酸序列。
8、本專利技術(shù)還提供了一種表達盒或重組載體，其含有所述突變型基因。
9、本專利技術(shù)還提供了所述水稻ssiiia突變型蛋白、所述突變型基因或所述表達盒或重組載體在培育突變型水稻中的應(yīng)用。
10、本專利技術(shù)還提供了所述水稻ssiiia突變型蛋白、所述突變型基因或所述表達盒或重組載體在提高水稻品質(zhì)中的應(yīng)用。
11、其中，所述提高水稻品質(zhì)包括提高稻米中的抗性淀粉含量。
12、本專利技術(shù)還提供了一種獲得純合突變水稻的方法，包括以下步驟：
13、1)設(shè)計ssiiia基因定點編輯的靶位點：基因編輯的靶位點核苷酸序列如seq?idno.9所示；
14、2)構(gòu)建含有目的片段的crispr/cas9胞嘧啶單堿基編輯載體：
15、2.1)靶點接頭制備：采用接頭引物用雙蒸水溶解成母液，母液稀釋，冷卻，即獲得靶點接頭；所述引物為sgrna-ssiiia-f和sgrna-ssiiia-r，其序列如seq?id?no.10和seqid?no.11所示；
16、2.2)將退火獲得的靶點片段連接到crispr/cas9胞嘧啶單堿基編輯載體上獲得連接產(chǎn)物；
17、2.3)將步驟2.2)中的連接產(chǎn)物進行熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組菌，提取通過驗證的含目的條帶菌液的陽性質(zhì)粒；
18、3)將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得t0轉(zhuǎn)基因植株，使用引物對t0轉(zhuǎn)基因植株進行擴增并測序鑒定獲得具備突變型蛋白的植株；所述引物為ssiiia?txt-f和ssiiiatxt-r，序列如seq?id?no.12和seq?id?no.13所示。
19、4)篩選獲得不含外源基因的水稻單株；
20、其中，所述外源基因包括篩選標記潮霉素抗性基因hpt和核酸酶基因cas9。所述不含外源基因的篩選通過對目標基因突變的t0轉(zhuǎn)基因植株自交獲得的t1植株的hpt、cas9和sgrna進行同時檢測。
21、其中，hpt、cas9和sgrna檢測方法為以t1植株的基因組dna為模板，分別以hyg-f和hyg-r、cas9-f和cas9-r以及sgrna-f和sgrna-r為引物進行pcr擴增。當均未同時檢測到hpt、cas9和sgrna，表明成功獲得了不含外源基因的目標單株。
22、5)不含外源基因t1植株ssiiia基因突變再鑒定并獲得目標基因純合突變植株。
23、其中，所述目標基因純合突變植株的獲得，是以步驟4)不含外源基因t1植株的基因組dna為模板，以ssiiia?txt-f和ssiiia?txt-r為引物進行pcr擴增并測序，從中篩選并獲得所述的突變型蛋白純合、所述的核酸或基因純合的植株。
24、本專利技術(shù)還提供了一種鑒定利用所述方法獲得的純合突變水稻稻米表型的方法，包括以下步驟：
25、1)測定所述水稻直鏈淀粉含量是否升高；和/或
26、2)測定所述水稻支鏈淀粉結(jié)構(gòu)是否變化；和/或
27、3)測定所述水稻抗性淀粉含量是否升高；和/或
28、4)測定所述水稻精米外觀是否透明。
29、氨基酸替換等位突變會導(dǎo)致ssiiia蛋白的活性受到影響，可以在保證一定稻米外觀和蒸煮食味品質(zhì)的情況下，提高rs含量。故本專利技術(shù)通過crispr/cas9技術(shù)對水稻ssiiia基因進行了定點突變，并獲得了ssiiia蛋白第1697位脯氨酸發(fā)生替換且rs含量升高的水稻新品系，為優(yōu)質(zhì)水稻品質(zhì)改良育種提供種質(zhì)(基因)資源。
30、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下顯著優(yōu)點：
31、1)本專利技術(shù)首次利用單堿基編輯技術(shù)，對ssiiia基因編碼區(qū)進行編輯，通過后代的篩選，在t1獲得不含有外源基因、稻米外觀透明、淀粉組分改變、抗性淀粉含量升高、能穩(wěn)定遺傳的新株系；相對于化學(xué)誘變、雜交育種等方法，基因編輯方法具有快速、精準、高效等優(yōu)點，極大提高育種效率，大大加快育種進程；
32、2)本專利技術(shù)的基因編輯技術(shù)育種得到的水稻材料的稻米直鏈淀粉含量分布在21％～29％之間，相比于野生型16％顯著增加本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種水稻SSIIIa突變型蛋白，其特征在于，所述SSIIIa突變型蛋白是將野生型SSIIIa蛋白的第1697位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼帷⒘涟彼峄虮奖彼岬玫降模凰鲆吧退維SIIIa蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻SSIIIa突變型蛋白，其特征在于，所述水稻SSIIIa突變型蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6～8任一項所示。
3.一種編碼權(quán)利要求1～2任一項所述水稻SSIIIa突變型蛋白的突變型基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變型基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3～5任一項所示。
5.一種表達盒或重組載體，其特征在于，其含有權(quán)利要求3～4任一項所述突變型基因。
6.權(quán)利要求1～2任一項所述水稻SSIIIa突變型蛋白、權(quán)利要求3～4任一項所述突變型基因或權(quán)利要求5所述表達盒或重組載體在培育突變型水稻中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1～2任一項所述水稻SSIIIa突變型蛋白、權(quán)利要求3～4任一項所述突變型基因或權(quán)利要求5所述表達盒或重組載體在提高
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述提高水稻品質(zhì)包括提高水稻中的抗性淀粉含量。
9.一種獲得純合突變水稻的方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.一種鑒定利用權(quán)利要求9所述方法獲得的純合突變水稻表型的方法，其特征在于，包括以下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種水稻ssiiia突變型蛋白，其特征在于，所述ssiiia突變型蛋白是將野生型ssiiia蛋白的第1697位氨基酸突變?yōu)榘腚装彼帷⒘涟彼峄虮奖彼岬玫降模凰鲆吧退緎siiia蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻ssiiia突變型蛋白，其特征在于，所述水稻ssiiia突變型蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.6～8任一項所示。
3.一種編碼權(quán)利要求1～2任一項所述水稻ssiiia突變型蛋白的突變型基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變型基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.3～5任一項所示。
5.一種表達盒或重組載體，其特征在于...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：韋存虛，史來權(quán)，張輝，趙勝男，林令尚，張龍，王娟，王文文，
申請(專利權(quán))人：揚州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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