【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及佐劑制備，具體而言，涉及一種皂樹皂苷21的制備方法。
技術(shù)介紹
1、疫苗佐劑是一類物質(zhì)，能夠非特異性地增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答。它們能誘發(fā)長期、高效的特異性免疫反應(yīng)，提高保護(hù)能力，同時(shí)減少免疫物質(zhì)的用量和降低疫苗生產(chǎn)成本，在現(xiàn)代疫苗具有重要意義。
2、as01是葛蘭素史克公司(gsk)開發(fā)的脂質(zhì)體類佐劑體系，包含兩種免疫佐劑組分：單磷酸脂質(zhì)a(mpl)和皂樹皂苷qs-21。組分qs-21從南美皂樹樹皮中提取，因其低毒性和高含量，被廣泛研究和應(yīng)用。qs-21由多個(gè)異構(gòu)體組成，qs-21是由多個(gè)異構(gòu)體組成的混合物，即含有8個(gè)糖基的酰化三萜皂苷類化合物。其結(jié)構(gòu)包括：母核皂皮酸的3位羥基連有支鏈三糖，28位羧酸連有線性四糖，以及一條以α-l-阿拉伯糖為末端糖基的脂肪酸通過酯鍵與巖藻糖基的4位羥基連接，結(jié)構(gòu)異構(gòu)體為qs-21api(芹菜糖65％)和qs-21xyl(木糖35％)。在水溶液中qs-21會(huì)發(fā)生酯鍵的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生位置異構(gòu)體，除主要異結(jié)構(gòu)qs-21a，(脂肪鏈連接巖藻糖基4位)，還有少量異構(gòu)體qs-21b(脂肪鏈連接巖藻糖基的3位)的產(chǎn)生。
3、qs-21通過多種機(jī)制增強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答，包括與apc細(xì)胞表面的凝集素相互作用、提供t細(xì)胞共刺激信號、與膽固醇相互作用、誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生和分泌il-1β/il-18。多年的臨床應(yīng)用表明：qs-21是一種安全、耐受性良好的免疫調(diào)節(jié)劑，目前已有多種基于qs-21的疫苗和創(chuàng)新藥物處于上市或臨床試驗(yàn)階段。qs-21產(chǎn)業(yè)化的瓶頸在于皂樹樹皮提取物中含量低
4、近年來，專利和文獻(xiàn)已經(jīng)公開一些qs-21的純化方法。kensil等在1991年的專利(us5057540)中，描述了一種純化qs-21的方法。首先對(皂樹樹皮提取物)進(jìn)行甲醇提取，提取物依次經(jīng)硅膠和反相c4樹脂對qs-21進(jìn)行純化，得到的產(chǎn)品在薄層色譜(tlc)中顯示為單一譜帶，但快原子轟擊質(zhì)譜(fab-ms)分析表明，它仍然是一種相當(dāng)復(fù)雜的混合物，未提及收率數(shù)據(jù)。kensil等在2001年和2003年專利中(us6231859；us6524584)描述了純化qs-21的兩個(gè)實(shí)例方法。第一種方法：先對皂樹樹皮提取物進(jìn)行透析和凍干處理，作為起始提取物，然后通過硅膠柱對qs-21進(jìn)行粗純，最后經(jīng)反相c18柱和較大顆粒尺寸的c18柱對qs-21進(jìn)行兩步精純。據(jù)專利描述，該方法收率約為2.95％，但需要注意的是，該起始提取物經(jīng)過透析富集后，其中qs-21含量比高，具體數(shù)據(jù)沒有報(bào)告。第二種方法：首先使用聚乙烯吡咯烷酮(pvpp)從quil-a中除去多酚類雜質(zhì)，然后在苯基柱上進(jìn)行兩次連續(xù)的樹脂純化步驟，最終在c8柱上進(jìn)行qs-21的精純，收率沒有報(bào)告。兩種純化方法得到的qs-21純度均≥98％(未展示hplc色譜圖)。但fab-ms顯示，除主要的qs-21離子外還有三種主要雜質(zhì)離子。該專利描述的兩種方法需要通過多次(3～4次)，不同類型的層析填料(涉及：硅膠、反相c18、較大顆粒尺寸c18、pvpp、苯基、c8)進(jìn)行純化，操作繁瑣，純化效率低，生產(chǎn)成本高，更為關(guān)鍵的是，在終產(chǎn)品中含有未知雜質(zhì)，無法應(yīng)用于qs-21產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
5、gsk在2019年專利(cn?111670044?a)中，描述了一種皂苷提取物(和疫苗中as01的一種成分)的純化方法。首先通過pvpp吸附皂樹樹皮提取物，然后經(jīng)聚苯乙烯柱、苯基柱、c8柱進(jìn)行純化，凍干后得到qs-21皂苷提取物。該方法收率沒有報(bào)告。uplc-uv/ms顯示，產(chǎn)品中‘qs-21主峰’(純度≥93％)是含有分子量1856、1988(qs-21)和2002的組分的混合物。最大的雜質(zhì)(0.25～3％)為‘2018組分’。該專利重點(diǎn)定義起始提取物中該成分含量的可接受范圍，大大限制了方法的適用性。因‘2018組分’在不同批次的提取物中含量差異較大并且無法通過專利方法去除，生產(chǎn)過程中常會(huì)出現(xiàn)偏離規(guī)范，產(chǎn)生不合格產(chǎn)品。故gsk在2020年專利(cn?114080393a)中進(jìn)行了修訂，描述了具有更高百分比‘2018組分’(>3％至10％)的皂苷提取物(qs-21主峰≥88％)顯示出類似的生物活性特征。gsk申請的2篇專利中描述的終產(chǎn)品并非高純度的qs-21，而是由分子量1856、1988(qs-21)和2002、2018雜質(zhì)(0.25～10％)以及一些其他皂苷類成分組成的混合物，即qs-21皂苷提取物。其主峰(1856、1988和2002)的純度僅≥88％。專利描述的整個(gè)生產(chǎn)工藝涉及多個(gè)純化步驟(pvpp+3次柱層析)、多種填料類型(涉及：pvpp、聚苯乙烯、苯基、c8)以及凍干步驟，因此其生產(chǎn)成本較高。因cn?114080393?a專利放寬了產(chǎn)品中主峰純度和2018雜質(zhì)占比的放行標(biāo)準(zhǔn)，推測其產(chǎn)率不高，產(chǎn)能無法滿足需求所致。
6、此外，qi等(qi?y,fox?c?b.j?chromatogr?a.2020,1635:461705)報(bào)道了一種兩步正交色譜法制備高純度qs-21的方法。該法以為起始提取物，不需要任何預(yù)處理，先后通過c18柱和hilic柱進(jìn)行純化。工程批驗(yàn)證結(jié)果顯示，批產(chǎn)量為339mg，收率～2.1％，產(chǎn)品純度為97.2％，不含有‘2018組分’雜質(zhì)。該文章的創(chuàng)新點(diǎn)之一是不需要任何預(yù)處理。然而起始提取物中含有大量的植物多酚、多糖和蛋白類成分。大量的經(jīng)層析柱純化時(shí)，這些雜質(zhì)將在c18填料中產(chǎn)生死吸附，造成其不可逆的損壞。該文章只報(bào)道了1批產(chǎn)量僅為百mg級的工程批數(shù)據(jù)，故該工藝的批間穩(wěn)定性有待多批次數(shù)據(jù)來驗(yàn)證。另一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)為使用hilic作為第二次層析填料。與常規(guī)的反相c18相比，hilic填料在使用中有一定的局限性，其填料壽命和重現(xiàn)性均顯著低于c18，價(jià)格昂貴。因此，該文章報(bào)道的純化方法不適用qs-21產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
7、綜上，目前qs-21專利報(bào)道的制備方法工藝復(fù)雜，qs-21純化效率低，生產(chǎn)成本較高，為了滿足高產(chǎn)量需求，只能以降低qs-21純度或者以含有qs-21的皂苷提取物來實(shí)現(xiàn)。而文獻(xiàn)公開的方法不適用產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因?yàn)樘崛∥镏谐嗽碥疹惓煞滞?，還存在其他雜質(zhì)(多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、多酚等)。提取物如果不經(jīng)預(yù)處理直接上柱純化，一些雜質(zhì)會(huì)死吸附在層析填料中，導(dǎo)致純化效果降低、甚至有堵塞層析柱的風(fēng)險(xiǎn)，無法保證產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。
8、鑒于此，特提出本專利技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種操作簡單易行、效率高、產(chǎn)能高、生產(chǎn)成本低、主峰產(chǎn)物純度高、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的皂樹皂苷21的制備方法，從而解決上述技術(shù)問題。
2、本專利技術(shù)是這樣實(shí)現(xiàn)的：
3、本專利技術(shù)提供了一種皂樹皂苷21的制備方法，其包括如下步驟：
4、s1：對皂素原料進(jìn)行預(yù)處理除雜：將體積分?jǐn)?shù)為75％-90％的醇溶劑與皂素原料接觸，去除不溶物獲得預(yù)處理除雜后的物質(zhì)；
5、s2：對預(yù)處理除雜后的物質(zhì)進(jìn)行第一次反向純化，第一次本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述醇溶劑選自一元醇、二元醇和三元醇中的至少一種；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，采用體積分?jǐn)?shù)為75％-80％的乙醇對皂素原料進(jìn)行溶解；或采用體積分?jǐn)?shù)為80％±5％的甲醇對皂素原料進(jìn)行溶解；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，第一次反向純化的色譜介質(zhì)和第二次反向純化的色譜介質(zhì)是SP-100-10-ODS-P；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述第一次反向純化時(shí)的酸性調(diào)節(jié)劑為甲酸、乙酸、三氟乙酸或磷酸；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述第二次反向純化時(shí)的酸性調(diào)節(jié)劑為甲酸、乙酸、三氟乙酸或磷酸；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括：步驟S4溶劑置換；
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述溶劑置換
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括：步驟S5超濾置換；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述超濾置換包括：將所述溶劑置換液與超濾置換液混合后的液體與經(jīng)超濾置換液潤洗后的超濾膜接觸，超濾濃縮，用所述超濾置換液連續(xù)清洗超濾膜，收集超濾濃縮后的產(chǎn)物和洗液；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述醇溶劑選自一元醇、二元醇和三元醇中的至少一種；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，采用體積分?jǐn)?shù)為75％-80％的乙醇對皂素原料進(jìn)行溶解；或采用體積分?jǐn)?shù)為80％±5％的甲醇對皂素原料進(jìn)行溶解；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，第一次反向純化的色譜介質(zhì)和第二次反向純化的色譜介質(zhì)是sp-100-10-ods-p；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的皂樹皂苷21的制備方法，其特征在于，所述第一次反向純化時(shí)的酸性調(diào)節(jié)劑為甲酸、乙酸、三氟乙酸或磷酸；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的皂樹皂苷2...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周丹丹，米卓爾，徐海玲，朱佳樂，周雨笑，高祺，隋強(qiáng)，陳德祥，
申請(專利權(quán))人：成都邁科康生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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