【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于抗體制備，具體涉及一種單分子熒光抗體、制備方法及應用。
技術介紹
1、流式細胞術是一種常用的細胞檢測技術，主要是利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞懸液進行多參數、快速分析或分選，從而實現對細胞表面蛋白、胞內蛋白、dna或rna等成分的分析。抗體是流式細胞術檢測的重要工具，通過抗體與細胞標志物的特異結合從而識別不同類型的細胞，將抗體跟熒光分子連在一起，用于信號的檢測，常用的熒光分子包括異硫氰酸熒光素(fitc)、藻紅蛋白(pe)、別藻藍蛋白(apc)等。目前，抗體與熒光蛋白分子的結合方式多為化學偶聯，但在化學偶聯的過程中會出現熒光分子標記不均一的問題，即：單個抗體分子上所連接的熒光分子個數不同；此外，在進行化學標記的過程中還可能會影響抗體與靶標分子的結合活性以及抗體本身的穩定性，導致檢測靈敏度降低。為提高細胞檢測的靈敏度和特異性，需要將抗體與熒光分子的定點定量標記，而傳統的化學標記方法難以實現這個目標，因此需要開發新的解決方案。
2、此外，完整的抗體分子由可變區和恒定區組成，可變區用于識別靶標分子，恒定區用于與fc受體結合發揮效應。在對細胞進行流式檢測的過程中，不僅抗體的可變區可以與靶標分子特異結合，抗體的恒定區也可以與表達fc受體的細胞結合，導致檢測結果出現假陽性。為解決這一問題，需要在檢測前加入fc阻斷劑來阻斷抗體恒定區與表達fc受體的細胞的結合，同時還需要加入同型對照抗體組作為對照組，導致實驗過程復雜繁瑣。
技術實現思路
1、鑒于此，本專利技術提供一種
2、為解決以上技術問題，本專利技術的第一方面提供一種單分子熒光抗體，包括融合表達的抗體可變區序列和熒光蛋白序列；其中，所述抗體可變區序列與熒光蛋白序列通過一接頭序列連接，所述接頭序列的基因序列如seq?id?no.1所示；所述單分子熒光抗體不包括抗體恒定區序列。
3、本專利技術提供的單分子熒光抗體，通過將抗體可變區序列與熒光蛋白序列通過特定的接頭序列seq?id?no.1連接，不僅實現了抗體可變區與熒光蛋白之間的定點、定量標記，還使所得單分子熒光抗體具有更高的檢測靈敏度和特異性，專利技術人推測，這是由于所選擇的接頭序列seq?id?no.1能夠同時與抗體可變區序列和熒光蛋白序列發生最大程度的“匹配”，進而減少了接頭序列的引入對抗體本身穩定性的影響。而且，該單分子熒光抗體僅表達抗體中與抗原結合的可變區，避免了因抗體的恒定區與表達fc受體細胞的結合導致流式細胞檢測結果出現假陽性而不得不使用fc阻斷劑的問題，大大簡化了檢測流程。
4、結合第一方面，所述抗體可變區序列由重鏈可變區和輕鏈可變區通過一短的柔性肽連接成一scfv形式，其中，所述柔性肽序列為ggsggsggsggsgg。
5、結合第一方面，所述抗體可變區序列和熒光蛋白序列融合表達的融合蛋白分子通過hek-293細胞或cho細胞重組表達。
6、結合第一方面，所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、青色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
7、本專利技術的第二方面提供一種上述單分子熒光抗體的制備方法，步驟包括：將所述抗體可變區序列和熒光蛋白序列通過如seq?id?no.1所示的接頭序列連接，通過細胞重組表達后、純化，獲得抗體-熒光蛋白融合分子，命名為單分子熒光抗體。
8、本專利技術提供的單分子熒光抗體的制備方法步驟簡單，易于操作，有利于產業化生產。
9、結合第二方面，選擇hek-293細胞或cho細胞作為重組表達的轉染細胞。
10、本專利技術的第三方面提供一種上述單分子熒光抗體在細胞檢測中的應用。
11、本專利技術的第六方面提供一種蛋白凍干粉，所述蛋白凍干粉由上述單分子熒光抗體經冷凍干燥工藝制得。現有的熒光抗體一般應在2～8℃保存，且不能在-20℃凍存，而本專利技術提供的單分子熒光抗體可采用冷凍干燥工藝制成蛋白凍干粉，并可在-20℃保存1年之久。
12、本專利技術提供的單分子熒光抗體與偶聯法得到的熒光抗體相比，具有更高的靈敏度和特異性，適用于不同類型的流式細胞檢測，且使用該單分子熒光抗體的細胞檢測實驗流程簡單，無需額外使用fc阻斷劑，也無需增加同型對照抗體處理組，提高了檢測效率。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種單分子熒光抗體，其特征在于，包括融合表達的抗體可變區序列和熒光蛋白序列；
2.如權利要求1所述的單分子熒光抗體，其特征在于，所述抗體可變區序列由重鏈可變區和輕鏈可變區通過一短的柔性肽連接成一ScFv形式，其中，所述柔性肽序列為GGSGGSGGSGGSGG。
3.如權利要求1～2任一項所述的單分子熒光抗體，其特征在于，所述抗體可變區序列和熒光蛋白序列融合表達的融合蛋白分子通過HEK-293細胞或CHO細胞重組表達。
4.如權利要求1所述的單分子熒光抗體，其特征在于，所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、青色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
5.一種權利要求1～4任一項所述的單分子熒光抗體的制備方法，其特征在于，步驟包括：
6.如權利要求5所述的單分子熒光抗體的制備方法，其特征在于，選擇HEK-293細胞或CHO細胞作為重組表達的轉染細胞。
7.一種權利要求1～4任一項所述的單分子熒光抗體在細胞檢測中的應用。
8.一種蛋白凍干粉，其特征在于，所述蛋白凍干粉由權利要求1～4任一項所述的單分子熒光抗
...【技術特征摘要】
1.一種單分子熒光抗體，其特征在于，包括融合表達的抗體可變區序列和熒光蛋白序列；
2.如權利要求1所述的單分子熒光抗體，其特征在于，所述抗體可變區序列由重鏈可變區和輕鏈可變區通過一短的柔性肽連接成一scfv形式，其中，所述柔性肽序列為ggsggsggsggsgg。
3.如權利要求1～2任一項所述的單分子熒光抗體，其特征在于，所述抗體可變區序列和熒光蛋白序列融合表達的融合蛋白分子通過hek-293細胞或cho細胞重組表達。
4.如權利要求1所述的單分子熒光抗體，其特征在...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張軍方，
申請(專利權)人：深圳市因諾賽生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。