【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及重組蛋白活性檢測，更具體的說是涉及一種基于hips細(xì)胞的vitronectin生物學(xué)活性檢測方法。
技術(shù)介紹
1、重組人vitronectin蛋白(vtn,玻連蛋白)能有效地與細(xì)胞外基質(zhì)集合，主要用于包被組織培養(yǎng)板，以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。在基質(zhì)中，玻連蛋白可以通過與各種整合素和其他蛋白多糖結(jié)合來支持細(xì)胞粘附。此外，vtn蛋白在hips細(xì)胞的培養(yǎng)和應(yīng)用中具有重要意義。作為一種高效、可靠的細(xì)胞培養(yǎng)試劑，vtn蛋白可以顯著提高h(yuǎn)ips細(xì)胞的生長和增殖速率，并促進(jìn)其向特定細(xì)胞系的分化，在最大程度上為ips細(xì)胞研究和應(yīng)用開辟新的道路。重組蛋白的活性檢測，是產(chǎn)品質(zhì)量檢測的一個關(guān)鍵參數(shù)，活性有無和優(yōu)劣直接關(guān)系到產(chǎn)品能否放行銷售、能否滿足客戶的使用需求。
2、vtn與其他常用細(xì)胞因子不同，目前暫無國際標(biāo)準(zhǔn)品可作為定量標(biāo)準(zhǔn)，這對用戶來說需要花費大量時間和經(jīng)濟(jì)成本進(jìn)行測試，確定實際用量濃度。目前市場上提供vtn定量活性檢測的只有基于vtn蛋白對腫瘤細(xì)胞的促黏附作用的檢測方法。然而腫瘤細(xì)胞自身就是貼壁細(xì)胞，實驗過程中的細(xì)胞清洗、細(xì)胞計數(shù)等關(guān)鍵操作，不同操作員、不同洗滌過程都會直接影響貼壁率的計算，從而對蛋白活性結(jié)果的判定造成很大影響。
3、因此，提供一種可準(zhǔn)確定量檢測vitronectin生物學(xué)活性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)提供了一種基于hips細(xì)胞的vitronectin生物學(xué)活性檢測方法。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human
2、為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、一種基于hips細(xì)胞的vitronectin生物學(xué)活性檢測方法，包括以下步驟：
4、(1)包被vitronectin蛋白：用1×dpbs將待測vtn蛋白稀釋至不同濃度作為包被液，每孔加入100μl，每個濃度包被3孔，37℃包被1～2h或2～8℃包被12～20h；
5、(2)準(zhǔn)備細(xì)胞：收集對數(shù)期的hips-b1細(xì)胞，按照細(xì)胞鋪板密度為2.5e4/cm2，計算96孔板每孔細(xì)胞數(shù)為0.8e4個細(xì)胞，根據(jù)樣品數(shù)計算此次實驗所需細(xì)胞總數(shù)n；
6、根據(jù)細(xì)胞計數(shù)中活細(xì)胞密度，計算取n個hips-b1細(xì)胞，需要的對數(shù)期的hips細(xì)胞的體積，并用5ml?1×dpbs離心清洗細(xì)胞一次；
7、按照每孔加入細(xì)胞體積為100μl，計算重懸細(xì)胞沉淀所需細(xì)胞維持液體積v；
8、將離心后的細(xì)胞沉淀，用v體積的細(xì)胞維持液重懸，并加入y-27632，使y-27632終濃度為10μmol/l，混勻待用，此為細(xì)胞終懸液；
9、(3)細(xì)胞鋪板：將步驟(1)包被好vtn蛋白的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出，吸棄包被液；步驟(2)中混勻的細(xì)胞終懸液，按每孔100μl加入包被好vtn蛋白的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，將細(xì)胞輕輕拍散，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19-21h；
10、(4)檢測及數(shù)據(jù)處理：
11、采用cck-8法對每孔進(jìn)行檢測，讀取od450值：吸棄孔中培養(yǎng)基，并每孔加入100μldmem/f12培養(yǎng)基清洗兩次；每孔加入100μl?dmem/f12培養(yǎng)基和10μl?cck-8試劑，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中孵育4h后，于酶標(biāo)儀讀取od450值；
12、采用graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以x軸為不同濃度vtn的值，y軸為od450值，采用四參數(shù)擬合s型曲線，得到ed50。
13、優(yōu)選的，步驟(1)所述不同濃度為20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml、0.156μg/ml、0.078μg/ml。
14、優(yōu)選的，步驟(2)所述細(xì)胞維持液為培養(yǎng)hips-b1的完全培養(yǎng)基。
15、有益效果：
16、本專利技術(shù)檢測方法對vtn蛋白活性的定量檢測，檢測過程中不涉及細(xì)胞計數(shù)等引入人員操作誤差的過程，受試驗人員、試驗條件變化影響較小，操作準(zhǔn)確、便捷，檢測周期短，方法穩(wěn)定性較好，可同時快速進(jìn)行多批次vtn的活性檢測。
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1.一種基于hiPS細(xì)胞的Vitronectin生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于hiPS細(xì)胞的Vitronectin生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述不同濃度為20μg/mL、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml、0.156μg/ml、0.078μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于hiPS細(xì)胞的Vitronectin生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述細(xì)胞維持液為培養(yǎng)hiPS-B1的完全培養(yǎng)基。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于hips細(xì)胞的vitronectin生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于hips細(xì)胞的vitronectin生物學(xué)活性檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述不同濃度為20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：霍景瑞，喬倩，韓宇，王立燕，
申請(專利權(quán))人：北京同立海源生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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