【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物基因工程，具體涉及一種大豆耐低磷基因gmak1及其應用。
技術介紹
1、磷素是作物生長發育所需的重要營養元素之一，在植物的生長、發育和繁殖過程中發揮著重要作用。磷元素不僅參與光合碳循環中核酸、膜脂、能量代謝產物和活性中間體的結構和功能成分，還在信號轉導級聯中起著關鍵作用。
2、土壤缺磷是農業生產中普遍存在的限制因子。我國耕地中有2/3缺磷，全世界耕地約有50％缺磷。研究表明，我國目前生產上所施的1/2磷肥被土壤固定而不能有效利用，造成經濟損失和生態環境污染；同時還存在作物生長期間有效磷營養不足、磷肥利用效益低、當季利用率低下等問題。
3、大豆根瘤形成是一個高耗能過程，需要大量磷素參與，缺磷將直接影響根瘤發育以及氮素固定，說明磷是維持大豆產量相對穩定的限制性因素。研究發現，菜豆、蠶豆和白羽扇豆等豆科植物的根系分泌物能提高土壤磷素的有效性，從而提高作物對難溶性磷酸鹽的活化。這主要是因為缺磷脅迫能增加豆科植物根系分泌物中有機酸的分泌量，顯著提高對難溶性磷的活化效果。由此可見，磷元素是大豆根系生長發育過程中必需的營養元素，對于促進根系的生長和營養吸收具有重要意義。
4、天冬氨酸代謝途徑是植物氨基酸合成的重要途徑，天冬氨酸可由天冬氨酸轉氨酶ast催化合成，也可由天冬酰胺水解生成，大豆的部分營養價值也體現在以天冬氨酸為前體的必需氨基酸含量上。研究發現，在生殖生長階段，低磷脅迫會使大豆根系天冬氨酸含量升高，且根系天冬氨酸的含量隨營養液中磷濃度的降低而升高。在磷饑餓水平下，大豆苗期根系包括l
5、天冬氨酸分解代謝途徑是植物氨基酸合成的重要途徑，其主要作用是合成賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸等必需氨基酸。研究表明天冬氨酸途徑中關鍵酶基因能夠控制合成的氨基酸含量。在經過遺傳改良的禾谷及豆科農作物中，調控天冬氨酸代謝途徑酶活性的高低會影響其對應的必需氨基酸含量。天冬氨酸激酶(ak)作為該途徑的第一個關鍵酶，其在部分微生物和藥用植物中的作用機制已有一些研究，但其在大豆響應低磷脅迫中的功能及該基因在分子水平的應用尚不明確。
技術實現思路
1、為解決現有技術中天冬氨酸激酶在大豆響應低磷脅迫中的功能及分子機制尚不明確的問題，本專利技術提供了一種大豆耐低磷基因gmak1及其應用。本專利技術的專利技術人在前期的研究中發現：磷高效大豆和磷低效大豆在低磷處理條件下，ak基因的表達量相較于其他酶基因差異顯著。在蛋白質組學的研究中發現該蛋白在響應低磷脅迫時同樣差異顯著，因此，我們推測該基因在低磷脅迫中發揮作用，但天冬氨酸激酶是直接響應低磷脅迫還是間接響應低磷脅迫還尚不清楚，且大豆gmak1基因在低磷脅迫下的功能如何也有待驗證。基于此，本專利技術通過研究gmak1過表達轉基因大豆對低磷脅迫的響應，對轉基因大豆和對照植株常磷處理、低磷處理下表型及生理指標進行分析，初步驗證gmak1基因的功能，同時，對互作蛋白進行篩選和驗證并鑒定，為大豆高產育種提供分子研究基礎和種質資源。
2、為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、本專利技術提供了一種大豆耐低磷基因gmak1，所述大豆耐低磷基因gmak1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述大豆耐低磷基因gmak1表達的蛋白的氨基酸序列如seq?idno.2所示。
4、gmak1是一種從大豆中克隆得到的耐低磷相關基因，是大豆植株調控天冬氨酸激酶催化天冬氨酸的主效基因，全長6234bp，其編碼的蛋白位于葉綠體中。
5、本專利技術還提供了一種包含所述大豆耐低磷基因gmak1的重組表達載體或所述重組表達載體的宿主細胞。
6、其中，所述重組表達載體包括所述大豆耐低磷基因gmak1，還包括所述大豆耐低磷基因gmak1的質粒。
7、優選地，所述質粒包括pgbkt7、pgadt7、pbwa(v)bs和pbwa(v)hs等載體。
8、本專利技術使用的酵母雙雜交ad和bd載體質粒分別是pgadt7和pgbkt7，陽性對照質粒為pgbkt7-53+pgadt7-t，陰性對照質粒pgbkt7-laminc+pgadt7-t。通過包含所述大豆耐低磷基因gmak1的重組表達載體pgbkt7是酵母雙雜交bait表達載體，旨在表達gal4?dna結合結構域與bait蛋白質的融合蛋白質；pgadt7是酵母雙雜交表達載體，旨在表達gal4激活結構域與目的蛋白質的融合蛋白質。
9、所述宿主細胞可理解為本領域技術人員在轉基因過程中所使用的宿主細胞，比如eha105農桿菌、dh5α大腸桿菌以及酵母菌株y2hgold。但隨著科技發展，所述宿主細胞的選擇也許會發生變化，或非轉基因目的的應用領域，也同樣涉及載體和工程菌的利用，但只有含有本專利技術所述基因或本專利技術所述的載體，均在本專利技術的保護范圍內。
10、所述宿主細胞包括所述大豆耐低磷基因gmak1。
11、優選地，所述的的大豆耐低磷基因gmak1的重組表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞中的任一種。
12、本專利技術還提供了所述大豆耐低磷基因gmak1或所述重組表達載體或宿主細胞在植物育種中的應用。
13、其中，植物為大豆。
14、優選地，通過提高所述大豆耐低磷基因gmak1在植物中的表達量，或者提高所述大豆耐低磷基因gmak1編碼的蛋白在植物中的活性，進而調節大豆天冬氨酸代謝途徑的對低磷條件的響應，進而調節大豆的耐低磷能力。
15、提高所述大豆耐低磷基因gmak1在植物中的表達量是通過向植物轉化入所述大豆耐低磷基因gmak1。
16、提高所述大豆耐低磷基因gmak1編碼的蛋白在植物中的活性是通過向植物轉化入包含所述大豆耐低磷基因gmak1表達的蛋白。
17、同時，本專利技術提供的上述大豆耐低磷基因gmak1、重組表達載體可用于酵母雙雜交篩選所述大豆耐低磷基因gmak1可能的互作蛋白。
18、過表達植株制備為本領域常規技術手段，本專利技術不另作限定，利用本專利技術所述基因進行大豆轉基因的技術方案均在本專利技術的保護范圍內。
19、本專利技術還提供了利用熒光定量pcr檢測所述大豆耐低磷基因gmak1的表達量，具體包括以下步驟：
20、大豆幼苗生長至v1時期，即第一個三小葉完全展開時，取復葉提取總rna、反轉錄，獲得cdna，以合成的cdna為模板，用gmak1-re-f引物(序列見seq?id?no.3所示)和gmak1-re-r引物(序列見seq?id?no.4所示)，檢測gmak1基因表達量。
21、其中，如seq?id?no.3所示的特異性引物的序列為gmak1-re-f：5’-ccatcctctcactcgaaact-3’。
22、其中，如seq?id?no.4所示的特本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種大豆耐低磷基因GmAK1，其特征在于，所述大豆耐低磷基因GmAK1的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述大豆耐低磷基因GmAK1表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。
2.一種包含權利要求1所述的大豆耐低磷基因GmAK1的重組表達載體或所述重組表達載體的宿主細胞。
3.根據權利要求2所述的大豆耐低磷基因GmAK1的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包括所述大豆耐低磷基因GmAK1，還包括所連接述大豆耐低磷基因GmAK1的質粒。
4.根據權利要求3所述的大豆耐低磷基因GmAK1的重組表達載體，其特征在于，所述質粒包括pGBKT7、pGADT7、pBWA(V)BS和pBWA(V)HS載體。
5.根據權利要求2所述的大豆耐低磷基因GmAK1的重組表達載體的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包括所述大豆耐低磷基因GmAK1。
6.根據權利要求5所述的的大豆耐低磷基因GmAK1的重組表達載體的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞中的任一種。
7.權
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述植物為大豆。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，通過提高所述大豆耐低磷基因GmAK1在植物中的表達量，或者提高所述大豆耐低磷基因GmAK1編碼的蛋白在植物中的活性，進而調節植物的耐低磷能力。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，提高所述大豆耐低磷基因GmAK1在植物中的表達量是通過向植物轉化入所述大豆耐低磷基因GmAK1；
...【技術特征摘要】
1.一種大豆耐低磷基因gmak1，其特征在于，所述大豆耐低磷基因gmak1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述大豆耐低磷基因gmak1表達的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
2.一種包含權利要求1所述的大豆耐低磷基因gmak1的重組表達載體或所述重組表達載體的宿主細胞。
3.根據權利要求2所述的大豆耐低磷基因gmak1的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包括所述大豆耐低磷基因gmak1，還包括所連接述大豆耐低磷基因gmak1的質粒。
4.根據權利要求3所述的大豆耐低磷基因gmak1的重組表達載體，其特征在于，所述質粒包括pgbkt7、pgadt7、pbwa(v)bs和pbwa(v)hs載體。
5.根據權利要求2所述的大豆耐低磷基因gmak1的重組表達載體的宿主細胞，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：敖雪，孫銘澤，劉子君，劉美玲，周嬋嬋，孫浩峰，
申請(專利權)人：沈陽農業大學，
類型：發明
國別省市：
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