【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物核酸分子檢測，涉及一種rt-rpa-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的引物、探針及檢測方法，特別涉及一種應用反轉錄后重組酶依賴擴增技術檢測方法(reverse?transcript?recombinase?ploymerase?amplification,rt-rpa)與側流層析試紙條檢測方法相結合的雙重檢測蜜蜂蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒引物、探針及其檢測方法。
技術介紹
1、蜜蜂是自然界中最主要的授粉昆蟲之一，對于許多農作物的繁殖至關重要。它們通過訪問花朵采集花蜜和花粉的過程中，實現了植物間的基因交流，提高了農作物的產量和質量。據估計，全球約有三分之一的農作物直接或間接地依賴于蜜蜂授粉，如水果、堅果、蔬菜、油料作物等，蜜蜂在維護生態系統中扮演著重要角色，對農業生產可持續發展和自然環境平衡起著至關重要的作用。目前，我國蜂群數量和蜂產品出口均居世界首位。能感染蜜蜂的病毒數量有20種，其中蜜蜂殘翅病毒(dwv)與黑蜂王臺病毒(bqcv)這兩種病毒在蜂群中多有檢出，是引起蜂群崩潰綜合癥的主要病原體之一。
2、目前對中蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的檢測包括癥狀診斷、電鏡觀察、血清學檢測和常規rt-pcr、rt-qpcr等分子生物學檢測方法。但癥狀診斷的癥狀表現可能因病毒株系、感染階段及蜜蜂個體差異而異，導致診斷不夠確切，易與其他疾病混淆；電鏡觀察癥狀表現可能因病毒株系、感染階段及蜜蜂個體差異而異，導致診斷不夠確切，易與其他疾病混淆；血清學檢癥狀表現可能因病毒株系、感染階段及蜜蜂個體差異而異，導致診斷
3、重組酶聚合酶擴增技術(rpa)由英國的twistdx?inc公司在2006年成功開發，并迅速在恒溫擴增
中嶄露頭角。rpa技術的一大亮點在于其能夠在23-45℃的溫度下，無需熱變性步驟，直接在常溫下高效完成核酸擴增。重組酶聚合酶擴增技術通過在擴增體系中引入生物素或地高辛分子標記的反向引物，以及5’端fam熒光標記的探針，并結合特制的脫堿基位點(dspacer或thf)作為dna修復酶和核酶nfo的識別切割位點，rpa實現了擴增與信號放大的同步進行，這一過程中，切割產生的新3’羥基末端在dna聚合酶的作用下繼續復制延伸，使得雙標記信號與擴增產物量直接相關，從而確保了檢測結果的特異性和敏感性。檢測結果通過抗fam金標結合和抗分子標記捕獲抗體的膠體金(gica)或膠體碳(ccica)側流層析試紙條進行可視化展示，使得整個檢測過程不僅快速簡便，而且無需復雜的實驗室設備，非常適合在野外等非傳統實驗室環境中進行。盡管rpa技術在多個領域展現出巨大潛力，但截至目前，重組酶聚合酶擴增技術(rpa)結合側流層析試紙條共同檢測蜜蜂殘翅病毒(dwv)和黑蜂王臺病毒(bqcv)國內外尚未見的報道。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是提供一種rt-rpa-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的引物、探針及檢測方法，將重組酶聚合酶擴增技術(rpa)結合側流層析試紙條應用于蜜蜂殘翅病毒(dwv)和黑蜂王臺病毒(bqcv)的rna檢測，具有靈敏度高、特異性強、操作程序簡單、檢測時間短的優點，適用于非實驗室環境下臨床現場檢測，具有廣泛的應用前景。
2、本專利技術采用如下技術方案：
3、一種rt-rpa-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的引物對和探針組合，具體為檢測蜜蜂殘翅病毒helicase基因和/或黑蜂王臺病毒vp1基因的引物對和探針，其中殘翅病毒helicase基因的正向引物序列如dwv-f所示，反向引物序列如dwv-r所示，探針序列包含如dwv-probe所示；黑蜂王臺病毒vp1基因的正向引物序列如bqcv-f所示，反向引物序列如bqcv-r所示，探針序列如bqcv-probe所示；
4、
5、所述以殘翅病毒helicase基因的探針，其dwv-probe所示序列5’端連接有第一標記分子，3’端連接有防止聚合反應的保護標簽，在距離5’端30個堿基左右的位置具有能被dna損傷修復活性的酶識別并切除的人工堿基；
6、所述黑蜂王臺病毒vp1基因的探針，其bqcv-probe所示序列5’端連接有第一標記分子，3’端連接有防止聚合反應的保護標簽，在距離5’端30個堿基左右的位置具有能被dna損傷修復活性的酶識別并切除的人工堿基；
7、所述殘翅病毒helicase基因的反向引物5’端連接有第二標記分子；
8、黑蜂王臺病毒vp1基因的反向引物5’端連接有第三標記分子。
9、所述殘翅病毒helicase基因的探針和正向引物處于同一擴增方向；所述黑蜂王臺病毒vp1基因的探針和正向引物處于同一擴增方向；
10、防止聚合反應的保護標簽為c3-spacer；能夠被具有dna損傷修復活性的酶識別并切除的所述人工堿基類似物為四氫呋喃(thf)；
11、所述第一標記分子為熒光分子fam，第二標記分子為地高辛(dig)，第三標記分子為生物素(biotin)。
12、本專利技術引物和探針選自以蜜蜂殘翅病毒或黑蜂王臺病毒特征片段，根據蜜蜂殘翅病毒或黑蜂王臺病毒特性設計，應用人工化學法合成并加入了特定大小的dna指紋序列以及分子標記。
13、上述引物對和探針組合在檢測殘翅病毒和/或黑蜂王臺病毒試劑中結合側流層析試紙條應用。
14、進一步地，所選擇的側流層析試紙條包括加樣墊、對照線、1號檢測線和/或2號檢測線。
15、進一步地，所述加樣墊含有膠體金/碳顆粒標記的所述第一標記分子特異結合物；所述對照線包被有第一標記分子的特異結合物；所述1號檢測線包被有第二標記分子特異結合物；所述2號檢測線包被有第三標記分子特異結合物；所述第一標記分子特異結合物為抗兔抗體；所述第二標記分子特異結合物為抗地高辛抗體；所述第三標記分子特異結合物為抗生物素抗體。
16、本專利技術還提供了一種rt-rpa-側流層析雙重檢測殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的方法，所述方法包括用rap技術擴增蜜蜂殘翅病毒helicase基因序列和/或黑蜂王臺病毒vp1基因序列，然后用側流層析試紙條顯示所述擴增產物。
17、具體地，所述方法包括如下步驟：
18、(1)提取待測樣本的總rna；采用病毒rna提取試劑盒提?。?/p>
19、(2)將上述rna利用上述殘翅病毒helicase基因的引物及探針和/或黑蜂王臺病毒vp1基因的引物及探針進行反轉錄及rpa擴增；
【技術保護點】
1.一種RT-RPA-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的引物、探針組合，其特征是：
2.一種RT-RPA-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒在側流層析試紙條中的應用。
3.根據權利要求2所述的RT-RPA-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒在側流層析試紙條中的應用，其特征是：所述側流層析試紙條包括加樣墊、對照線、1號檢測線和/或2號檢測線。
4.根據權利要求3所述的RT-RPA-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒在側流層析試紙條中的應用，其特征是：
5.一種非診斷治療目的的利用權利要求1所述蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的引物、探針組合對RT-RPA-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的檢測方法，其特征是：
6.根據權利要求5所述的RT-RPA-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的檢測方法，其特征是：
7.根據權利要求6所述的RT-RPA-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的檢測方法，其特征是：反應條件為：37℃的恒溫金屬浴中溫浴15min。
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【技術特征摘要】
1.一種rt-rpa-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒的引物、探針組合，其特征是：
2.一種rt-rpa-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒在側流層析試紙條中的應用。
3.根據權利要求2所述的rt-rpa-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒在側流層析試紙條中的應用，其特征是：所述側流層析試紙條包括加樣墊、對照線、1號檢測線和/或2號檢測線。
4.根據權利要求3所述的rt-rpa-側流層析雙重檢測蜜蜂殘翅病毒和黑蜂王臺病毒在側流層析試紙條中的應用，其特征是：
5.一種非診斷治療目的的利...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李明，孫莉，費東亮，張月，殷雪晨，王冠，范恩鑫，馬鳴瀟，
申請(專利權)人：錦州醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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