分子設計的結合藻藍膽素ＰＣＢ的藻紅藍蛋白β亞基類熒光蛋白及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種結合藻藍膽素ＰＣＢ的藻紅藍蛋白β亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，其序列為序列１、序列２、序列３和序列４；并公開了融合鏈霉親和素的熒光蛋白直接用于熒光免疫檢測的方法；藻紅藍蛋白ｂｅｔａ亞基保守的第１５３位半胱氨酸殘基可以通過硫醚鍵結合藻藍膽素ＰＣＢ，通過基因工程利用大腸桿菌制備得到熒光藻紅藍蛋白的ｂｅｔａ亞基，這類蛋白的光譜性質與天然藻紅藍蛋白不同，同時由于帶有Ｈｉｓ－ｔａｇ標記，不僅便于提純，還有助于改善其溶解性，與鏈霉親和素形成融合蛋白，可以直接用于免疫熒光檢測，有利于其在各個領域中的應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術本專利技術涉及一種分子設計的結合藻藍膽素PCB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白及其應用，屬于生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及分子設計的結合藻藍膽素PCB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，以及利用此融合蛋白檢測可溶性抗原或抗體的檢測方法。
技術介紹
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC) 。 CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發射約660 670nm的熒光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ;PEC的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ;PEC的beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ;CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。 可以從藻類中提取得到藻紅藍蛋白，并分離出其alpha和beta亞基，alpha亞基的80位半胱氨酸殘基通過硫醚健共價結合藻藍膽素PCB， beta亞基82位和153位半胱氨酸殘基分別通過硫醚健共價結合藻藍膽素PCB;也可以通過基因工程利用大腸桿菌進行生產。PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(TooleyAJ，GlazerAN. Biosynthesis of thecyanobacterial light—harvesting polypeptidephycoerythrocyanin holo-alpha sub皿it in ^heterologous host. J Bacteriol. 2002 j184(17) :4666 4671)。 PEC的beta亞基也可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產。我們發現，利用基因工程，可以得到藻紅藍蛋白beta亞基82位結合藻藍膽素PCB的熒光蛋白，其光譜性質與天然藻紅藍蛋白不同(如圖1、圖2所示)，同時還可以對其肽鏈氨基酸進行突變、進行有益的標記。 鏈霉親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈霉親和素_生物素系統，可以實現信號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素_生物素系統已經廣泛應用于生物學檢測和醫療檢測等領域。目前主要是通過化學交聯實現鏈霉親和素對目標的標記。本專利技術通過基因工程技術，把鏈霉親和素基因和藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內表達得到鏈霉親和素和藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直4接實現鏈霉親和素和藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白的連接；通過藻膽蛋白beta裂合酶能催化藻藍膽素與藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質共價結合，從而生成具有優良熒光性質的鏈霉親和素標記的結合PCB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(其光譜如圖3、圖4所示)。此蛋白可直接應用于免疫熒光檢測等領域。 免疫熒光技術(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種免疫熒光技術(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標記而獲得成功。 用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。以熒光抗體方法較常用。 該技術的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是非特異性染色問題尚未完全解決，技術程序也還比較復雜。同時，由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。 藻膽蛋白性質穩定，其熒光性質受到環境影響較小，適合作為熒光探針使用。本專利技術中的藻膽蛋白已經直接標記有鏈霉親和素，利用間接檢測法，通過生物素_鏈霉親和素系統，利用鏈霉親和素標記的熒光藻膽蛋白與生物素標記的抗抗體結合，從而實現對抗原的檢測。生物素-鏈霉親和素提高了檢測的靈敏度，同時由于抗抗體的通用性，使本檢測方法可以方便的用于各種抗原的檢測；熒光藻膽蛋白具有優良的熒光性質，較高的熒光效率、較大波長的熒光發射峰，可以提高檢測靈敏度，減少本底熒光的影響。本方法有利于熒光藻膽蛋白在免疫檢測中應用的推廣。 藻膽蛋白目前正逐漸在各種領域得到廣泛應用，特別是在免疫熒光檢測方面有很大的開發利用前景。通過改造后具有較高熒光效率、帶有可利用標記的藻膽蛋白，會大大提升其在免疫熒光檢測中的應用價值，這為藻膽蛋白在醫藥和生物工程領域的應用奠定了基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種分子設計的結合藻藍膽素PCB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體的氨基酸序列，并標明其色素結合位點，同時提供利用鏈霉親和素標記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測方法。這類鏈霉親和素標記的結合藻藍膽素PCB的藻紅藍蛋白beta亞基具有與天然藻類中存在的藻紅藍蛋白beta亞基不同的結構，并且其熒光光譜性質也有極大區別，同時，提供了此類帶有鏈霉親和素標記的結合藻藍膽素PCB的藻紅藍蛋白beta亞基用于檢測可溶性抗原的方法它是利用抗體與抗原特異性反應、鏈霉親和素可以與生物素特異結合的原理，利用鏈霉親和素標記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體。 為了解決上述問題，本專利技術所采用的技術方案是 結合藻藍膽素PCB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，將藻紅藍蛋白beta亞基 編碼基因克隆于表達質粒，利用藻紅藍蛋白beta裂合酶表達質粒以及藻藍膽素PCB合成酶 質粒，可以在大腸桿菌中合成結合PCB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，并且標明了其 色素結合位點，該類蛋白質序列N端具有His-tag標記，但是His-tag標記不限于N端。 所述的結合藻藍膽素PCB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白的序列為序列1 : 所述的結合藻藍膽素PCB是指藻藍膽素PC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種結合藻藍膽素ＰＣＢ的藻紅藍蛋白ｂｅｔａ亞基類熒光蛋白，其特征在于：藻藍膽素ＰＣＢ通過硫醚鍵結合在重組藻紅藍蛋白ｂｅｔａ亞基２０１位，相當于原始藻紅藍蛋白ｂｅｔａ亞基的１５３位。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：夏坤，佟順剛，
申請(專利權)人：廣州天寶頌原生物科技開發有限公司，
類型：發明
國別省市：81[中國|廣州]