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    磷脂酶D-Sp-256-A409C及其應用制造技術
    
                            
    技術編號：43252313 閱讀：100 留言：0更新日期：2024-11-08 20:35
    
                        
    
                        
    
                            
                            本發明專利技術公開了一種磷脂酶D?Sp?256?A409C及其應用，屬于功能酶技術領域。所述磷脂酶D?Sp?256?A409C的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。所述磷脂酶D?Sp?256?A409C在制備DHA磷脂酰乙醇胺中的應用。本發明專利技術還提供了一種制備DHA磷脂酰乙醇胺的方法。本發明專利技術對磷脂酶D?Sp?256進行了突變改造，篩選得到了磷脂酶D?Sp?256?A409C，其合成DHA磷脂酰乙醇胺的底物轉化率高達91.2%，轉酯活力可達115.0μg/h/mg，可滿足工業生產和應用的要求，具有廣闊的應用前景。
    
                            
                            
    


    
                            

                            
    【技術實現步驟摘要】
    
                                
    本專利技術涉及一種磷脂酶d-sp-256-a409c及其應用，屬于功能酶。

    技術介紹
    1、磷脂一類廣泛存在于自然界中的含磷脂質，根據其極性頭基的不同可以分為磷脂酰膽堿（pc）、磷脂酰乙醇胺（pe）、磷脂酰肌醇（pi）、磷脂酰絲氨酸（ps）等，其中pe具有多種生理活性，對大腦功能、神經發育、抗腫瘤活性、脂質代謝等均有積極影響。目前，dha磷脂酰乙醇胺（dhape，dha指二十二碳六烯酸）因其在氧化穩定性、生物利用效率和營養功能等方面的優勢越來越受到關注，制備高純度的dhape具有廣闊的市場前景。
    2、磷脂酶d（phospholipase?d，pld）即磷脂酰膽堿水解酶，是一種高效的磷脂改性催化劑，可以選擇性合成各種稀有磷脂，比如dhape。不同結構的磷脂酶d有不同的底物譜、催化效率、穩定性、產物抑制性等特性。目前尚未見到利用磷脂酶d高效合成dhape的相關報道。

    技術實現思路
    1、針對上述現有技術，本專利技術提供了一種磷脂酶d-sp-256-a409c及其應用，屬于功能酶
    2、本專利技術是通過以下技術方案實現的：
    3、一種磷脂酶d-sp-256-a409c，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
    4、所述磷脂酶d-sp-256-a409c的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
    5、所述磷脂酶d-sp-256-a409c在制備dha磷脂酰乙醇胺中的應用。
    6、具體應用時，以dha磷脂酰膽堿（dhapc）和乙醇胺鹽酸鹽為底物，在磷脂酶d-sp-256-a409c的催化作用下，合成dha磷脂酰乙醇胺。
    7、進一步地，合成dha磷脂酰乙醇胺的具體過程如下：將20?mg?dha磷脂酰膽堿溶于1ml有機溶劑環戊基甲醚中；將130?mg乙醇胺鹽酸鹽和10～50?μg的磷脂酶d-sp-256-a409c溶于1?ml緩沖液中；將二者混合均勻，在40℃水浴、200?rpm的搖床中反應8?h；所述緩沖液為ph?6.0、20?mmol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，含50?mmol/l的氯化鈣。
    8、所述dha磷脂酰膽堿來源于魷魚卵，魷魚卵中含有較高含量的多不飽和脂肪酸磷脂，且dha含量較高。從魷魚卵中提取dha磷脂酰膽堿常采用有機溶劑浸提法（現有技術中的常規技術手段）。
    9、本專利技術還提供了一種制備dha磷脂酰乙醇胺的方法，如下：以dha磷脂酰膽堿和乙醇胺鹽酸鹽為底物，在磷脂酶d-sp-256-a409c的催化作用下，合成dha磷脂酰乙醇胺。
    10、進一步地，具體過程如下：將20?mg?dha磷脂酰膽堿溶于1?ml有機溶劑環戊基甲醚中；將130?mg乙醇胺鹽酸鹽和10～50?μg的磷脂酶d-sp-256-a409c溶于1?ml緩沖液中；將二者混合均勻，在40℃水浴、200?rpm的搖床中反應8?h；所述緩沖液為ph?6.0、20?mmol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，含50?mmol/l的氯化鈣。
    11、本專利技術通過研究發現磷脂酶d-sp-256可以用于合成dha磷脂酰乙醇胺，但底物轉化率僅為26.9%，不甚理想。因此，本專利技術對磷脂酶d-sp-256進行了突變改造，篩選得到了磷脂酶d-sp-256-a409c，其合成dha磷脂酰乙醇胺的底物轉化率高達91.2%，轉酯活力可達115.0?μg/h/mg，相比磷脂酶d-sp-256提高了5.0倍，可滿足工業生產和應用的要求，具有廣闊的應用前景。
    12、本專利技術使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義。
    本文檔來自技高網...
                            
    
                            
    【技術保護點】
    
                                
    1.一種磷脂酶D-Sp-256-A409C，其特征在于：氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
    2.權利要求1所述的磷脂酶D-Sp-256-A409C的編碼基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
    3.權利要求1所述的磷脂酶D-Sp-256-A409C在制備DHA磷脂酰乙醇胺中的應用。
    4.根據權利要求3所述的磷脂酶D-Sp-256-A409C在制備DHA磷脂酰乙醇胺中的應用，其特征在于：以DHA磷脂酰膽堿和乙醇胺鹽酸鹽為底物，在磷脂酶D-Sp-256-A409C的催化作用下，合成DHA磷脂酰乙醇胺。
    5.根據權利要求4所述的磷脂酶D-Sp-256-A409C在制備DHA磷脂酰乙醇胺中的應用，其特征在于，合成DHA磷脂酰乙醇胺的具體過程如下：將20?mg?DHA磷脂酰膽堿溶于1?mL有機溶劑環戊基甲醚中；將130?mg乙醇胺鹽酸鹽和10～50?μg的磷脂酶D-Sp-256-A409C溶于1mL緩沖液中；將二者混合均勻，在40℃水浴、200?rpm的搖床中反應8?h；所述緩沖液為pH6.0、20?mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，含50?mmol/L的氯化鈣。
    6.一種制備DHA磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：以DHA磷脂酰膽堿和乙醇胺鹽酸鹽為底物，在權利要求1所述的磷脂酶D-Sp-256-A409C的催化作用下，合成DHA磷脂酰乙醇胺。
    7.根據權利要求6所述的制備DHA磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于：將20?mg?DHA磷脂酰膽堿溶于1?mL有機溶劑環戊基甲醚中；將130?mg乙醇胺鹽酸鹽和10～50?μg的磷脂酶D-Sp-256-A409C溶于1?mL緩沖液中；將二者混合均勻，在40℃水浴、200?rpm的搖床中反應8h；所述緩沖液為pH?6.0、20?mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，含50?mmol/L的氯化鈣。
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    【技術特征摘要】
    
                                
    1.一種磷脂酶d-sp-256-a409c，其特征在于：氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
    2.權利要求1所述的磷脂酶d-sp-256-a409c的編碼基因，其特征在于：核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
    3.權利要求1所述的磷脂酶d-sp-256-a409c在制備dha磷脂酰乙醇胺中的應用。
    4.根據權利要求3所述的磷脂酶d-sp-256-a409c在制備dha磷脂酰乙醇胺中的應用，其特征在于：以dha磷脂酰膽堿和乙醇胺鹽酸鹽為底物，在磷脂酶d-sp-256-a409c的催化作用下，合成dha磷脂酰乙醇胺。
    5.根據權利要求4所述的磷脂酶d-sp-256-a409c在制備dha磷脂酰乙醇胺中的應用，其特征在于，合成dha磷脂酰乙醇胺的具體過程如下：將20?mg?dha磷脂酰膽堿溶于1?ml有機溶劑環戊基甲醚中；將130?mg乙醇胺鹽酸鹽和10～50?...
                            
    
                            
    【專利技術屬性】
    
                                技術研發人員：孫建安，陳曦，毛相朝，賀晨曦，刁汝靜，
    
        申請(專利權)人：中國海洋大學，
    
        類型：發明
    
        國別省市：
    
                            
    
                            
                        
    
                    
    
                    
                    
                     
                
    
                
                
    
                    
    
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