【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，特別涉及一種prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白、疫苗及應用。
技術介紹
1、目前在市面上還沒有商品化的豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型二聯疫苗，但相關的研究從未停止。作為prrsv具有較好免疫原性的gp3和gp5蛋白，pcv2的cap蛋白，相關研究利用這三個蛋白的編碼基因構建了prrs和pcv2二聯核酸疫苗，為prrsv與pcv2二聯疫苗打下了研究基礎。同時也有采用分離的pcv2和prrsv強毒株研制而成的pcvad和prrs二聯滅活疫苗。另外還有研究者專利技術了一種將含有prrs活病毒(r98株)和pcv2(sh株)滅活病毒聯合凍干制備二聯疫苗的方法，在其攻毒保護試驗中可以為免疫豬提供較好的保護。目前市場上已有prrs與pcvad的單苗，但免疫程序的不一致導致需要進行多次注射接種，這樣的免疫方式易使動物產生應激，而且增加了工作量；雖然多聯疫苗使用相對方便，但部分疫苗的免疫抗原成分之間會相互干擾，影響免疫效果。所以，通過桿狀病毒表達系統表達prrsv與pcv2免疫原性好的蛋白，用于研制二者二聯疫苗的技術基礎可以認為是可行的。
2、桿狀病毒表達載體系統(bevs)是以桿狀病毒為載體插入外源基因高效表達外源蛋白的表達系統。由于桿狀病毒的感染專一性，對哺乳動物沒有致病性，因此被人們廣泛應用。哺乳動物表達系統可對表達的蛋白進行正確修飾和折疊，以轉基因的形式表達等優勢，但其表達速度較慢，成本較高，不適合大規模生產。酵母表達系統也能對表達的蛋白進行修飾，可通過酵母分泌表達，成本相對
3、目前，prrs和pcvad已成為影響我國養豬業發展的兩種重要傳染病，流行病學調查顯示，兩種病原體的混合感染在pcvad病例中很常見，由此造成的豬免疫抑制和機體抵抗力下降，容易繼發多種病毒或細菌的感染，嚴重影響了豬群的生產性能，給養豬業帶來了巨大的經濟損失。現階段對于疫病的防控仍然是以這兩種疫病的單苗免疫為主，多次免疫引起的不良應激和不同抗原成分相互的干擾均影響了免疫的效果。因此，簡化免疫程序，研制更安全高效的二聯疫苗對預防和控制pcvad和prrs的發生與流行具有重要意義。
技術實現思路
1、為了克服現有技術的不足和缺點，本專利技術的首要目的在于提供一種prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白。
2、本專利技術的另一目的在于提供上述重組蛋白的制備方法。
3、本專利技術的再一目的在于提供上述重組蛋白的應用。
4、本專利技術的第四個目的在于提供一種疫苗，該疫苗包含上述重組蛋白。
5、本專利技術的目的通過下述技術方案實現：
6、一種prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白，包含重組gp5蛋白和重組gp3蛋白、重組tbcap蛋白和重組m蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no：1～4所示；
7、所述的重組gp5蛋白和重組gp3蛋白、重組tbcap蛋白和重組m蛋白的核苷酸序列如seq?id?no：5～8所示；
8、一種包含編碼上述prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白的基因的多基因表達盒，所述的編碼重組gp5蛋白的基因和編碼重組gp3蛋白的基因分別與polyhedrin(polh)啟動子連接；所述的編碼重組tbcap蛋白的基因和編碼重組m蛋白的基因與p10啟動子連接；且polyhedrin啟動子和p10啟動子方向相反；
9、一種包含上述多基因表達盒的重組轉移質粒，通過如下方法制備得到：
10、(1)將含nhe?i和xho?i酶切位點的編碼重組tbcap蛋白的基因序列和重組轉移質粒pfbdm-gp5分別采用nhe?i和xho?i酶切后并連接，得到pfbdm-gp5-tbcap；所述的重組轉移質粒pfbdm-gp5是將編碼重組gp5蛋白的基因與pfbdm連接得到；
11、(2)將含nhe?i和xho?i酶切位點的編碼重組m蛋白的基因序列和重組轉移質粒pfbdm-gp3分別采用nhe?i和xho?i酶切后并連接，得到pfbdm-gp3-m；所述的組轉移質粒pfbdm-gp3是將編碼重組gp3蛋白的基因與pfbdm連接得到；
12、(3)通過限制性核酸內切酶pmei/avrii酶切pfbdm-gp5-tbcap，得到gp5和tbcap基因的表達盒；通過限制性核酸內切酶bstz17i/spei將pfbdm-gp3-m切開；
13、(4)將獲得的gp5和tbcap基因的表達盒與酶切后的pfbdm-gp3-m進行連接，得到重組轉移質粒pfbdm-gp3-gp5-m-tbcap；
14、一種重組桿狀病毒質粒，由上述重組轉移質粒pfbdm-gp3-gp5-m-tbcap轉化dh10multibac感受態細胞得到；
15、一種重組桿狀病毒，由上述重組桿狀病毒質粒rbac-tbcap-gp3-gp5-m轉染sf9昆蟲細胞，分離純化得到；
16、所述的prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白的制備方法，包含如下步驟：
17、將上述重組桿狀病毒轉染high-five細胞，轉染后離心，棄上清；重懸細胞并裂解，離心，收集上清即為prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白；
18、所述的轉染m.o.i.優選為5.0，轉染時間優選為72～96h；
19、所述的prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白在制備豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型二聯疫苗中的應用；
20、一種豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型二聯疫苗，包含上述prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白；
21、所述的疫苗優選還包含isa201vg佐劑；
22、所述的疫苗的制備方法，包含如下步驟：
23、將prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白與佐劑混合，得到疫苗；
24、所述的prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白與佐劑的質量比優選為1:1；
25、本專利技術的原理：
26、根據genbank上收錄的nadc30-like?orf3/orf6(登錄號：jn654459.1)序列，于終止子前添加編碼6×his標簽蛋白的堿基序列，經昆蟲細胞密碼子偏愛性優化后，得到重組gp3和m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種PRRSV-GP3-GP5-M+PCV2-TBCap重組蛋白，其特征在于包含重組GP5蛋白和重組GP3蛋白、重組TBCap蛋白和重組M蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No：1～4所示。
2.根據權利要求1所述的PRRSV-GP3-GP5-M+PCV2-TBCap重組蛋白，其特征在于：
3.一種包含編碼權利要求1或2所述的PRRSV-GP3-GP5-M+PCV2-TBCap重組蛋白的基因的多基因表達盒，其特征在于所述的編碼重組GP5蛋白的基因和編碼重組GP3蛋白的基因分別與polyhedrin啟動子連接；所述的編碼重組TBCap蛋白的基因和編碼重組M蛋白的基因與p10啟動子連接；且polyhedrin啟動子和p10啟動子方向相反。
4.一種包含上述多基因表達盒的重組轉移質粒，其特征在于通過如下方法制備得到：
5.一種重組桿狀病毒質粒，其特征在于由權利要求4所述的重組轉移質粒pFBDM-GP3-GP5-M-TBCap轉化DH10Multibac感受態細胞得到。
6.一種重組桿狀病毒，其特征在于由權利要求5所述的重組
7.權利要求1或2所述的PRRSV-GP3-GP5-M+PCV2-TBCap重組蛋白的制備方法，其特征在于包含如下步驟：
8.權利要求1或2所述的PRRSV-GP3-GP5-M+PCV2-TBCap重組蛋白在制備豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型二聯疫苗中的應用。
9.一種豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒2型二聯疫苗，其特征在于包含權利要求1或2所述的PRRSV-GP3-GP5-M+PCV2-TBCap重組蛋白。
10.根據權利要求9所述的疫苗，其特征在于：所述的疫苗還包含ISA201VG佐劑。
...【技術特征摘要】
1.一種prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白，其特征在于包含重組gp5蛋白和重組gp3蛋白、重組tbcap蛋白和重組m蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no：1～4所示。
2.根據權利要求1所述的prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白，其特征在于：
3.一種包含編碼權利要求1或2所述的prrsv-gp3-gp5-m+pcv2-tbcap重組蛋白的基因的多基因表達盒，其特征在于所述的編碼重組gp5蛋白的基因和編碼重組gp3蛋白的基因分別與polyhedrin啟動子連接；所述的編碼重組tbcap蛋白的基因和編碼重組m蛋白的基因與p10啟動子連接；且polyhedrin啟動子和p10啟動子方向相反。
4.一種包含上述多基因表達盒的重組轉移質粒，其特征在于通過如下方法制備得到：
5.一種重組桿狀病毒質粒，其特征在于由權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳金頂，吉俊芝，黃竣聰，羅子鵬，房依琦，袁忠茂，杜鵬飛，謝凱源，劉雪怡，黃瑤瑤，朱帥奇，張利紅，易琳，范雙旗，趙明秋，丁紅星，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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