【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于利用基因工程技術制備人血清白蛋白的生物，具體來說是一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法。
技術介紹
1、分子生物學技術的發展為利用生物反應器生產外源蛋白提供了許多方法和手段。到目前為止，已發展出了大腸桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等多種外源蛋白表達系統。巴斯德畢赤酵母(pichia.pastoris)基因表達系統經過近三十年發展，已成為目前表達外源蛋白的最重要宿主之一，如宿主菌gs115(cregg，et?al(2009).methods?enzymol.463，169–189；us?patent4，879，231，phillips?petroleum，1989)。該系統具有易于高密度發酵，目的基因穩定整合在宿主基因組，能使表達產物有效分泌并適度糖基化，培養基價廉經濟等特點。該基因表達系統利用了高效可調控啟動子aox1，已高效表達了hbsag、tnf、egf、破傷風毒素c片段、基因工程抗體等數千種外源蛋白，證實該系統為高效、實用、簡便，以及提高表達量并保持產物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統，而且非常適宜于中試放大并擴大為工業化規模生產。
2、利用畢赤酵母表達外源基因一般包括以下步驟:①將外源基因插入畢赤酵母重組表達載體；②用內切酶處理線性化的重組質粒，再轉化畢赤酵母菌株；③將轉化液涂布在md平板上進行陽性重組子的首輪篩選；④用內含g418不同濃度梯度的ypd平板進行陽性重組子的第2輪篩選；⑤進一步鑒定外源基因在酵母基因組中的整合情況；⑥小規模誘導表達鑒定外源基因的表達水平；⑦利用生物反應
3、為了篩選到高拷貝數的陽性克隆，需要用不同濃度梯度的g418平板進行篩選，預實驗的g418濃度梯度設定為0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0mg/ml。據invitrogen公司推薦的protocol上介紹了篩選方案。第一種方法是制備不同濃度梯度的g418平板，用影印的方法將his4營養缺陷平板上的陽性克隆逐一影印到g418梯度平板上進行高拷貝數克隆的篩選。這種方法的特點是工作量巨大(在影印之前還需連續轉接培養3次，以保證影印時每個單轉化子的濃度相當)，篩選難度高，周期長，而且篩選的轉化子數相對較少，不能做高通量篩選。第二種方法同樣需要制備不同濃度梯度的g418平板，不同的是可以用無菌水或液體培養基將his4營養缺陷平板上生長出來的全部陽性轉化子洗下來，再將其稀釋至合適的濃度，取一定量稀釋液體分別涂到內含g418不同濃度梯度平板上，這種方法的操作相對簡易，能篩選到的轉化子較多。但針對含不同的目的基因或不同畢赤酵母宿主菌，需要預先做預實驗來探索菌液稀釋度的試驗。這兩種篩選方案是目前國內外科技工作者利用畢赤酵母表達系統表達外源蛋白時使用的通用篩選方法。但是它們共同的缺點就是g418的用量大，操作繁瑣，工作量大，費時費力，不同畢赤酵母宿主菌的篩選方法的通用性較差。
技術實現思路
1、1.專利技術要解決的技術問題
2、本專利技術的目的在于解決現有的基因重組人血清白蛋白制備產物存在基因表達水平低、發酵過程控制工藝不成熟(由于發酵規模大，往往需要十噸或幾十噸大型發酵罐，而大罐的過程控制與檢測手段缺乏先例和工具)，及重組人血清白蛋白的純化工藝不成熟(由于重組人血清白蛋白是特例，目的蛋白的純化規模及設備特別大型化，而目的蛋白的純度要求特別高，純度要求達到99.99％以上)，即純化步驟多達十幾步，純化介質載量低，純化效率低及純化回收率低等問題。
3、2.技術方案
4、為達到上述目的，本專利技術提供的技術方案為：
5、本專利技術的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
6、s1、制備新型宿主菌，所述新型宿主菌為巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)hsa-c16，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.30175，保藏日期為2024年03月28日；
7、s2、發酵；
8、s3、純化。
9、優選地，所述新型宿主菌為通過將重組表達載體導入巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)cbs7435菌株而得到的表達基因重組hsa的工程菌，所述重組表達載體的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。
10、優選地，所述重組表達載體包含：
11、(1)一種巴斯德畢赤酵母菌來源的5’調控區，內含啟動子元件，這種5’調控區選自畢赤酵母來源的醇氧化酶aox1基因、二羥基丙酮合成酶das1基因或組氨醇脫氫酶his4基因，調控區的3’末端與下述(2)的序列相連接；
12、(2)一種編碼人血清白蛋白的優化基因，其中包含的核苷酸序列如seq?id?no:2所示，其中包含的氨基酸序列如seq?id?no:3所示；
13、(3)一種甲醇酵母來源的3'終止序列，這種3'終止序列選自巴斯德畢赤酵母來源的aox1基因、aox2基因或his4基因的3’終止序列。
14、優選地，還包括
15、至少一種可供在大腸桿菌中篩選的標記基因；
16、一種在大腸桿菌宿主菌內能復制的復制起點的dna片段；
17、還包含至少二種可供在酵母中篩選的標記基因。
18、優選地，所述重組表達載體為ppic9、ppic3、ppiczαabc、ppic3.5k、phil-s1、phil-d2、pa0804、pa0815、pgapzαabc、ppic6αabc、ppic9k中的任意一種通過限制性內切酶saci或bglⅱ酶切后的線性化載體。
19、優選地，所述重組表達載體為hsa-ppic9k通過限制性內切酶saci或bglⅱ酶切后的線性化載體，其中至少含有一個拷貝的優化設計的編碼人血清白蛋白的優化基因。
20、優選地，所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，選用巴斯德畢赤酵母醇氧化酶(aox1)基因偏愛的偏愛密碼子并控制該基因偏愛密碼子占編碼的優化基因密碼子總數的90％。
21、優選地，所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，在優化基因內部從5’至3’方向依次插入了sali、hind?iii、xba?i三個本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述新型宿主菌為通過將重組表達載體導入巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)CBS7435菌株而得到的表達基因重組HSA的工程菌，所述重組表達載體的核苷酸序列如SEQID?NO：1所示。
3.根據權利要求2所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述重組表達載體包含：
4.根據權利要求2所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：還包括
5.根據權利要求2所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述重組表達載體為pPIC9、pPIC3、pPICZαABC、pPIC3.5K、pHIL-S1、pHIL-D2、pA0804、pA0815、pGAPZαABC、pPIC6αABC、pPIC9K中的任意一種通過限制性內切酶SacI或BglⅡ酶切后的線性化載體。
6.根據權利要求5所述的一種
7.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，選用巴斯德畢赤酵母醇氧化酶(AOX1)基因偏愛的偏愛密碼子并控制該基因偏愛密碼子占編碼的優化基因密碼子總數的90％。
8.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，在優化基因內部從5’至3’方向依次插入了SalI、Hind?III、Xba?I三個限制性內切酶位點，使優化基因相對均衡地被分割成四個大片段。
9.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，減少連續的G-C配對，增加畢赤酵母偏愛的A-T配對，使優化基因內部的GC含量調整至45～50％。
10.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，還包括表達閱讀框架為
11.根據權利要求1所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟S2的發酵具體包括
12.根據權利要求1所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟S210的培養基包括如下組分：H3PO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O、KOH、生物素、氨水、98％glycerol或100％甲醇，及消泡劑。
13.根據權利要求12所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述H3PO4的含量為26.7ml/L，所述CaSO4·2H2O的含量為0.47g/L，所述K2SO4的含量為9.1g/L，所述MgSO4·7H2O的含量為7.5g/L，所述KOH的含量為4.13g/L，所述98％glycerol的含量為40g/L，所述消泡劑的含量為0.5ml/L。
14.根據權利要求11所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟S200中的電極標定具體為對發酵罐進行pH電極標定和溶氧電極標定。
15.根據權利要求11所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟S230投料具體為將步驟S210制備的培養基混合液投入后，進行高溫滅火冷卻備用。
16.根據權利要求11所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟S250的發酵包括基礎培養階段、過渡培養階段和誘導表達階段。
17.根據權利要求16所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述基礎培養階段具體為
18.根據權利要求17所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述過渡培養階段具體為
19.根據權利要求18所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述誘導表達階段具體為
20.根據權利要求1所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟S3的純化具體為
21.根據權利要求20所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：...
【技術特征摘要】
1.一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述新型宿主菌為通過將重組表達載體導入巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)cbs7435菌株而得到的表達基因重組hsa的工程菌，所述重組表達載體的核苷酸序列如seqid?no：1所示。
3.根據權利要求2所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述重組表達載體包含：
4.根據權利要求2所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：還包括
5.根據權利要求2所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述重組表達載體為ppic9、ppic3、ppiczαabc、ppic3.5k、phil-s1、phil-d2、pa0804、pa0815、pgapzαabc、ppic6αabc、ppic9k中的任意一種通過限制性內切酶saci或bglⅱ酶切后的線性化載體。
6.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述重組表達載體為hsa-ppic9k通過限制性內切酶saci或bglⅱ酶切后的線性化載體，其中至少含有一個拷貝的優化設計的編碼人血清白蛋白的優化基因。
7.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，選用巴斯德畢赤酵母醇氧化酶(aox1)基因偏愛的偏愛密碼子并控制該基因偏愛密碼子占編碼的優化基因密碼子總數的90％。
8.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，在優化基因內部從5’至3’方向依次插入了sali、hind?iii、xba?i三個限制性內切酶位點，使優化基因相對均衡地被分割成四個大片段。
9.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，減少連續的g-c配對，增加畢赤酵母偏愛的a-t配對，使優化基因內部的gc含量調整至45～50％。
10.根據權利要求5所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述編碼人血清白蛋白的優化基因中，還包括表達閱讀框架為
11.根據權利要求1所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟s2的發酵具體包括
12.根據權利要求1所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟s210的培養基包括如下組分：h3po4、caso4·2h2o、k2so4、mgso4·7h2o、koh、生物素、氨水、98％glycerol或100％甲醇，及消泡劑。
13.根據權利要求12所述的一種高效獲得高純度重組人血清白蛋白的制備方法，其特征在于：所述h3po4的含量為26.7ml/l，所述caso4·2...
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