【技術實現步驟摘要】
本申請涉及分子生物，具體而言，涉及一種用于構建微生物靶向測序文庫的引物組合物及其應用。
技術介紹
1、第二代測序(next-generation?sequencing)又稱為高通量測序，而靶向測序(tngs)是使用多重pcr擴增或探針富集的方式獲得大量的目標片段，再結合二代測序平臺對富集的片段進行測序的技術。第二代測序可用于環境微生物檢測、引起動物疾病的微生物檢測、引起植物病害的微生物檢測及監測、引起人疾病的微生物檢測等多個領域。
2、現有的多重pcr檢測技術，在整個實驗過程中需要進行兩輪pcr，即第一輪pcr通過特異性引物捕獲目標基因片段，第二輪pcr再通過帶有分子標簽的接頭引物富集目標片段。整個實驗過程中，每完成第一輪pcr后需要開蓋取出樣本，使用磁珠進行一輪純化，獲得的純化產物在第二輪pcr中當模板，接頭引物完成擴增后進行二次純化，最后獲得完整的上機文庫，質檢合格后測序。
3、然而上述進行兩輪pcr反應，操作繁瑣；如需要配置兩次試劑，純化兩次，操作過程中出錯的概率增大；兩輪pcr的實驗準備和反應時間長；且由于原始模板在pcr儀中經過20~30個循環擴增，高濃度的擴增產物若處理不當容易產生氣溶膠，可能污染同批次實驗的其他樣本，從而出現結果的假陽性，影響最終的實驗結果判定。因此，亟需一種能實現高效準確的用于微生物檢測的相關技術和產品。
技術實現思路
1、基于此，有必要提供一種高效準確的用于構建微生物靶向測序文庫的引物組合物及其應用。
2、本申請
3、所述擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物從5’到3’端依次包括p5接頭序列、正向測序引物序列和與目標區域匹配的序列；所述反向引物從5’到3’端包括依次相連的反向測序引物序列和與目標區域匹配的序列；其中，所述目標區域匹配的序列的核苷酸序列如seq?id?no:1所示；
4、所述接頭引物從5’到3’端依次包括p7接頭序列、標簽序列、反向測序引物序列。
5、本申請采用接頭引物和擴增引物的組合方式，可一步反應同時完成目標區域擴增和含有特異性標簽的文庫構建。pcr反應原理示意圖如圖1所示，首先，在pcr反應前期，正反擴增引物與模板結合，獲得少量的不完整結構模板，由于模板片段中只連有p5接頭序列，未連接p7接頭序列，這些片段無法被測序芯片讀取；隨著pcr反應的持續進行，由于擴增引物中的反向引物的逐漸消耗，擴增引物中的正向引物再與接頭引物組合擴增，獲得完整結構的測序文庫；實現了擴增引物和接頭引物與pcr反應體系在一輪pcr后即可獲得完整測序文庫，同時整個建庫過程中，只需要純化一次，簡化了操作步驟，縮短了操作時間，降低了污染風險，提高了低濃度和復雜結構的樣本的檢出效率。
6、在其中一個實施例中，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno:2所示；和/或
7、所述反向引物的核苷酸序列如seqidno:3所示；和/或
8、所述標簽序列為6bp～10bp的核苷酸片段。
9、在其中一個實施例中，所述引物組合物還包括富集引物，所述富集引物包括第一富集引物和第二富集引物，所述第一富集引物包括p5接頭序列，所述第二富集引物包括p7接頭序列；
10、可選地，所述第一富集引物的核苷酸序列如seq?id?no:20所示；和/或
11、所述第二富集引物的核苷酸序列如seq?id?no:21所示。
12、本申請的第二方面，提供一種上述的引物組合物在制備微生物檢測產品中的應用。
13、本申請的第三方面，提供一種微生物檢測試劑盒，所述試劑盒包括上述的用于構建微生物靶向測序文庫的引物組合物。
14、本申請的第四方面，提供一種構建測序文庫的方法，包括：
15、獲取待測菌種的核酸樣本，利用上述的引物組合物對待測菌種的核酸樣本進行擴增。
16、在其中一個實施例中，所述利用上述的引物組合物對待測菌種的核酸樣本進行擴增包括：
17、利用擴增引物和接頭引物對待測菌種的核酸樣本進行一步pcr擴增，獲得測序文庫。
18、在其中一個實施例中，所述pcr擴增滿足以下（1）~（3）中的至少一個條件：
19、（1）在所述pcr擴增的反應體系中，5μm正向擴增引物與5μm反向擴增引物的總投入量比為（1~3）：1；
20、（2）所述核酸樣本來源包括痰液、肺泡灌洗液、口腔拭子及培養物中的至少一種；
21、（3）所述pcr擴增的程序包括：94℃~98℃反應25s~35s；94℃~96℃反應10s~20s，55℃~65℃反應25s~35s，70℃~74℃反應25s~35s，循環25次~35次；70℃~74℃反應3min~5min。
22、本申請的第五方面，提供一種測序方法，包括：獲取待測菌種的測序文庫，所述測序文庫采用上述的方法構建得到；
23、對待測菌種的測序文庫進行測序得到待測菌種的測序數據。
24、本申請的第六方面，提供一種鑒定目標菌種的方法，包括：
25、獲取待測菌種的測序數據，所述測序數據根據上述的測序方法得到；
26、根據所述測序數據確定待測菌種的類型。
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1.一種用于構建微生物靶向測序文庫的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物包括擴增引物和接頭引物；
2.根據權利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID?No:2所示；和/或
3.根據權利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物還包括富集引物，所述富集引物包括第一富集引物和第二富集引物，所述第一富集引物包括P5接頭序列，所述第二富集引物包括P7接頭序列；
4.權利要求1~3任一項所述的引物組合物在制備微生物檢測產品中的應用。
5.一種微生物檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1~3任一項所述的用于構建微生物靶向測序文庫的引物組合物。
6.一種構建測序文庫的方法，其特征在于，包括：
7.根據權利要求6所述的構建測序文庫的方法，其特征在于，所述利用權利要求1~3任一項所述的引物組合物對待測菌種的核酸樣本進行擴增包括：
8.根據權利要求7所述的構建測序文庫的方法，其特征在于，所述PCR擴增滿足以下（1）~（3）中的至少一個條件：
9.一種測
10.一種鑒定目標菌種的方法，其特征在于，包括：
...【技術特征摘要】
1.一種用于構建微生物靶向測序文庫的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物包括擴增引物和接頭引物；
2.根據權利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如seqid?no:2所示；和/或
3.根據權利要求1所述的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物還包括富集引物，所述富集引物包括第一富集引物和第二富集引物，所述第一富集引物包括p5接頭序列，所述第二富集引物包括p7接頭序列；
4.權利要求1~3任一項所述的引物組合物在制備微生物檢測產品中的應用。
5.一種微生物檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曾祥拱，唐瓊麗，馮兵，謝檳，
申請(專利權)人：深圳市大道測序生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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