【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程，具體涉及一種重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法及其在橫紋肌溶解相關急性腎損傷中的應用。
技術介紹
1、急性腎損傷(aki)是橫紋肌溶解癥(rm)的重要并發癥。當橫紋肌細胞因擠壓、缺血等原因而被破壞，一些細胞內容物如肌紅蛋白(mb)、鉀離子等進入血液循環中。繼而引起以肌紅蛋白血癥、肌紅蛋白尿、高鉀血癥、代謝性酸中毒和急性腎損傷甚至多器官功能障礙為特點的臨床綜合征。約10-60％的rm患者因高肌紅蛋白血癥導致急性腎損傷。目前沒有確實有效治療橫紋肌溶解相關急性腎損傷(rm-aki)的靶向藥物，患者預后較差。
2、觸珠蛋白(hp)屬于急性期血漿蛋白家族，幾乎只在肝臟中合成，在應激反應中迅速上調。在rm-aki期間的腎皮質中，hp基因快速、顯著和持續性的表達，并且可能通過抗氧化與調節炎癥反應影響急性腎損傷的發病機制和/或結果。損傷嚴重時會導致hp蛋白耗竭，從而危害機體健康。此外，hp最初被發現作為血紅蛋白最重要的血漿解毒劑。以人類血液為來源的hp蛋白靜脈注射制劑已在日本獲批上市，用于治療與溶血反應相關的血紅蛋白血癥和血紅蛋白尿癥。鑒于mb與血紅蛋白α亞基在結構上的同源性，推測血紅蛋白α亞基的結合位點，即觸珠蛋白β亞基(hpβ)蛋白，能夠特異性地結合mb。然而，hpβ蛋白能否通過與急性腎損傷期間損傷相關因子相互作用發揮潛在的治療作用仍有待進一步探討。此外，市面上銷售的hp蛋白的主要來源是珍貴的人源血漿，不易于大量獲得和投入研究。
3、申請公布號為cn110724185a的專利技術專利公開了重組人
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種重組人觸珠蛋白β亞基基因，該人觸珠蛋白β亞基基因經密碼子優化并引進gst標簽，可以簡單快速地制備重組人觸珠蛋白β亞基蛋白，且得到的重組人觸珠蛋白β亞基蛋白可直接用于體外gstpulldown實驗，應用范圍廣，有助于進一步研究人觸珠蛋白β亞基蛋白結合和清除血清肌紅蛋白的能力。
2、本專利技術的第二個目的是提供一種重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，從而優化人觸珠蛋白β亞基蛋白表達水平。
3、本專利技術的第三個目的是提供一種重組人觸珠蛋白在橫紋肌溶解相關急性腎損傷藥物治療中的應用。
4、為了實現以上目的，本專利技術采取的技術方案為：一種重組人觸珠蛋白β亞基基因，所述重組人觸珠蛋白β亞基基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
5、一種如上述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，包括以下步驟：將人觸珠蛋白β亞基基因片段以宿主細胞表達系統的密碼子偏好性為基準進行核苷酸序列優化，將優化后的人觸珠蛋白β亞基基因插入原核表達載體pgex-6p-1，構建重組表達載體pgex-6p-1-hpβ，將pgex-6p-1-hpβ轉化到宿主細胞感受態細胞c，獲得重組人觸珠蛋白β亞基工程菌株c-pgex-6p-1-hpβ，將c-pgex-6p-1-hpβ進行培養，然后加入iptg誘導表達重組人gst-hpβ蛋白包涵體；將得到的重組人gst-hpβ蛋白包涵體進行純化，即得。
6、進一步的，所述重組表達載體的構建方法包括以下步驟：將優化后的人觸珠蛋白β亞基基因命名為opt-hpβ基因；設計pcr引物，正向引物序列為5’-ccggaattccgtattctgggtggtcatc-3’，反向引物序列為5’-gtgctcgagttaattttctgcaatggttttc-3；使用所述pcr引物對所述opt-hpβ基因進行pcr擴增，將opt-hpβ基因的擴增產物用eori/xhoi進行雙酶切處理，將雙酶切后含有opt-hpβ基因的基因片段回收；用ecori和xhoi對原核表達載體pgex-6p-1進行雙酶切處理，然后將雙酶切后含有原核表達載體pgex-6p-1的載體片段回收；將回收的載體片段與基因片段進行連接反應后，轉化到感受態細胞c，獲得工程菌株pgex-6p-1-hpβ。
7、進一步的，所述c-pgex-6p-1-hpβ的培養方法包括以下步驟：挑取工程菌株c-pgex-6p-1-hpβ單菌落接種于lb培養基中，搖床振蕩培養過夜；將過夜培養的c-pgex-6p-1-hpβ的菌液接種到lb培養基中，培養至c-pgex-6p-1-hpβ菌液的od600達到0.4～0.6時，加入iptg誘導表達重組人gst-hpβ蛋白包涵體。
8、進一步的，所述重組人gst-hpβ蛋白包涵體的純化包括以下步驟：誘導表達重組人gst-hpβ蛋白包涵體，將誘導表達結束后的培養液離心，收集下層菌體沉淀，重選菌體，冰浴超聲破碎菌體，離心后用人gst-hpβ蛋白包涵體洗滌緩沖液洗滌菌體沉淀，用人gst-hpβ蛋白包涵體溶解緩沖液使菌體沉淀變性溶解；將含有重組人gst-hpβ蛋白包涵體的變性后溶液用透析緩沖液進行透析復性；將含有重組人gst-hpβ蛋白包涵體的復性后溶液負載到gst標簽蛋白瓊脂糖純化柱上，用15倍柱體積的洗雜緩沖液洗純化柱，再用洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液用10kda超濾管濃縮并更換為pbs溶液。
9、進一步的，所述宿主細胞感受態細胞c包括但不限于大腸桿菌bl21(de3)、shufflet7-b。
10、如上述方法獲得的重組人觸珠蛋白在橫紋肌溶解相關急性腎損傷藥物治療中的應用。
11、本專利技術的有益效果：
12、本專利技術針對重組人觸珠蛋白β亞基在原核細胞表達系統中的表達難點，采用密碼子優化技術，構建可在原核細胞表達系統中高效表達的細胞株，為觸珠蛋白β亞基蛋白的產率提供了保障。
13、本專利技術構建帶有gst標簽的重組人觸珠蛋白β亞基的原核表達載體，通過轉化大腸桿菌bl21(de3)菌株，獲得重組蛋白表達的工程菌，進而獲得重組蛋白的表達，純化得到的重組人觸珠蛋白β亞基蛋白可直接用于體外gstpulldown實驗。
14、本專利技術提供一種蛋白產率高及操作簡便的人觸珠蛋白β基因原核表達載體構建方法，可以簡單快速地制備重組人觸珠蛋白β亞基蛋白，規避人源血漿的問題，并且復配相應的緩沖體系和純化策略，為人觸珠蛋白β亞基蛋白的產量、純度和活力提供了技術保障。
15、本專利技術中帶有gst標簽的重組人觸珠蛋白β亞基蛋白能夠特異性地結合肌紅蛋白，對橫紋肌溶解相關急性腎損傷小鼠發揮治療作用。此外，重組人觸珠蛋白β亞基蛋白還可能通過與急性腎損傷期間其他損傷相關因子相互作用發揮本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種重組人觸珠蛋白β亞基基因，其特征在于，所述重組人觸珠蛋白β亞基基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.一種如權利要求1所述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟：將人觸珠蛋白β亞基基因片段以宿主細胞表達系統的密碼子偏好性為基準進行核苷酸序列優化，將優化后的人觸珠蛋白β亞基基因插入原核表達載體pGEX-6P-1，構建重組表達載體pGEX-6P-1-Hpβ，將pGEX-6P-1-Hpβ轉化為宿主細胞感受態細胞C，獲得重組人觸珠蛋白β亞基工程菌株C-pGEX-6P-1-Hpβ，將C-pGEX-6P-1-Hpβ進行培養，然后加入IPTG進行誘導表達重組人GST-Hpβ蛋白包涵體；將得到的重組人GST-Hpβ蛋白包涵體進行純化，即得。
3.根據權利要求2所述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，其特征在于，所述重組表達載體的構建方法包括以下步驟：將優化后的人觸珠蛋白β亞基基因命名為OPT-Hpβ基因；設計PCR引物，正向引物序列為5’-CCGGAATTCCGTATTCTGGGTGGTCATC-3’，反向引物序列為5’-GTGC
4.根據權利要求2所述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，其特征在于，所述C-pGEX-6P-1-Hpβ的培養方法包括以下步驟：挑取工程菌株C-pGEX-6P-1-Hpβ單菌落接種于LB培養基中，搖床振蕩培養過夜；將過夜培養的C-pGEX-6P-1-Hpβ的菌液接種到LB培養基中，培養至C-pGEX-6P-1-Hpβ菌液的OD600達到0.4～0.6時，加入IPTG誘導表達重組人GST-Hpβ蛋白包涵體。
5.根據權利要求2所述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，其特征在于，所述重組人GST-Hpβ蛋白包涵體的純化包括以下步驟：誘導表達重組人GST-Hpβ蛋白包涵體，將誘導表達結束后的培養液離心，收集下層菌體沉淀。重懸菌體，冰浴超聲破碎菌體，離心后用人GST-Hpβ蛋白包涵體洗滌緩沖液洗滌菌體沉淀，用人GST-Hpβ蛋白包涵體溶解緩沖液使菌體沉淀變形溶解；將含有重組人GST-Hpβ蛋白包涵體的變性后溶液用透析緩沖液進行透析復性；將含有重組人GST-Hpβ蛋白包涵體的復性后溶液負載到GST標簽蛋白瓊脂糖純化柱上，用15倍柱體積的洗雜緩沖液洗純化柱，再用洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液用10KDa超濾管濃縮并更換為PBS溶液。
6.根據權利要求2所述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，其特征在于，所述宿主細胞感受態細胞C包括但不限于大腸桿菌BL21(DE3)、ShuffleT7-B。
7.如權利要求2所述的方法獲得的重組人觸珠蛋白在橫紋肌溶解相關急性腎損傷藥物治療中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種重組人觸珠蛋白β亞基基因，其特征在于，所述重組人觸珠蛋白β亞基基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種如權利要求1所述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，其特征在于，包括以下步驟：將人觸珠蛋白β亞基基因片段以宿主細胞表達系統的密碼子偏好性為基準進行核苷酸序列優化，將優化后的人觸珠蛋白β亞基基因插入原核表達載體pgex-6p-1，構建重組表達載體pgex-6p-1-hpβ，將pgex-6p-1-hpβ轉化為宿主細胞感受態細胞c，獲得重組人觸珠蛋白β亞基工程菌株c-pgex-6p-1-hpβ，將c-pgex-6p-1-hpβ進行培養，然后加入iptg進行誘導表達重組人gst-hpβ蛋白包涵體；將得到的重組人gst-hpβ蛋白包涵體進行純化，即得。
3.根據權利要求2所述的重組人觸珠蛋白β亞基表達純化方法，其特征在于，所述重組表達載體的構建方法包括以下步驟：將優化后的人觸珠蛋白β亞基基因命名為opt-hpβ基因；設計pcr引物，正向引物序列為5’-ccggaattccgtattctgggtggtcatc-3’，反向引物序列為5’-gtgctcgagttaattttctgcaatggttttc-3；使用所述pcr引物對所述opt-hpβ基因進行pcr擴增，將opt-hpβ基因的擴增產物用eori/xhoi進行雙酶切處理，將雙酶切后的含有opt-hpβ基因的基因片段回收；用ecori和xhoi對原核表達載體pgex-6p-1進行雙酶切處理，然后將雙酶切后的含有原核表達載體pgex-6p-1的載體片段回收；將回收的載體片段與基因片段進行連接反應后...
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