【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程，特別是涉及一種細胞實時凋亡率檢測方法，具體是細胞工程。
技術介紹
1、熱療是一種通過提高腫瘤組織溫度，引起細胞的熱損傷和凋亡以達到治療目的的方法。正常組織對熱療的耐受性不同，并且不同的腫瘤類型需要不同的熱劑量。sakaguchi等人通過全身熱療的方式處理了纖維肉瘤和結腸癌的大鼠模型，發現結腸癌對溫度更加敏感，其腫瘤凋亡比例在處理后8h達43%且持續凋亡。熱療的效果取決于溫度和作用時間，在高于42.5–43℃的溫度下，溫度每升高1℃，作用時間可以減半，就可以達到等效的細胞殺滅率。
2、腫瘤細胞熱療效果取決于溫度和作用時間，不同的熱療溫度和升溫控制程序對肝癌細胞凋亡影響極大。如何通過實時檢測細胞凋亡率對于熱療治療腫瘤疾病，高效殺滅腫瘤細胞具有重要意義，特別是通過實時檢測細胞凋亡率可以更好的分析熱療控溫程序效用，以分析不同的生物體環境或熱療溫度、熱療升溫速度的影響，實現細胞凋亡率的精準監控分析。
3、因此，有望通過優化熱療的控制參數，達到較低的副作用的同時，實現較高的腫瘤細胞殺滅作用，降低因為腫瘤治療手段導致的不良影響，提高腫瘤疾病的治療效果。
4、現有技術只有根據固定溫度和固定時間研究方法，缺少對于熱療過程中腫瘤細胞實時凋亡率的研究技術，導致熱療技術的科學化高效運用受限，未能真正發揮其治療腫瘤疾病的價值。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是針對現有技術對于熱療殺滅腫瘤細胞的研究局限于特定溫度熱療前后的比較，無法充分科學研究熱
2、為了實現上述專利技術目的，提供以下技術方案：
3、一種細胞實時凋亡率檢測方法，包括以下步驟：
4、s1、在ito電極上刻蝕形成中央圓點和周圍圓形圖形，并使中央圓點和周圍圓形圖像分隔開；
5、然后，將ito電極嵌入細胞培養池中；
6、s2、將ito層的周圍圓形圖形與電化學工作站的三電極系統中的工作電極相連，
7、將ito層的中央圓點與三電極系統中對電極相連，
8、在細胞培養池中插入ag/agcl電極與三電極系統中參比電極相連；
9、構建得到電化學生物傳感器；
10、s3、將構建得到的電化學生物傳感器放置到光學平臺上；然后，將整個光學平臺放置在細胞培養箱中，通過電腦中安裝的活細胞動態監測分析處理軟件來接收光學平臺的圖像傳感器的信號；
11、s4、將細胞培養池滅菌，加入含有細胞的懸液，使細胞附著在ito電極上形成1-4層細胞的細胞基底；
12、然后，加入含有待測試藥物成分的培養基，進行培養；或者，采用熱療工藝，加入培養基，在熱療溫度進行培養；
13、s5、開始實驗，啟動活細胞動態監測分析處理軟件，使用光學平臺實時觀察培養池中細胞的凋亡變化；同時，通過電化學工作站使用阻抗檢測法實時測定細胞在ito電極上貼壁生長所產生的電阻信號變化；
14、s6、通過活細胞動態監測分析處理軟件實時采集細胞覆蓋率的數據，通過電化學工作站實時采集細胞電阻信號變化數據；
15、以時間為橫坐標，以細胞覆蓋率變化和電阻信號變化為縱坐標作圖，展示細胞實時凋亡率。
16、本專利技術方法通過將顯微鏡實時觀察細胞凋亡率和ito電極之間的電阻信號結合，對細胞凋亡率進行連續的數據分析和圖像分析，相比于傳統的細胞凋亡率實驗方法，能夠更好的獲得細胞凋亡率數據中的時間特性，能夠用于分析藥物濃度對于細胞造成殺滅作用的生效時間進度變化過渡情況。一方面可以更好的用于藥物開發過程中，藥物活性濃度的精準研究；另一方面，也可以用于指導臨床用藥技術的研究，制定最優用藥方案，使得藥物在適宜的工作濃度下，最大化殺傷作用，最小化副作用影響。
17、進一步，在s1中，在ito電極上刻蝕形成中央圓點，并使中央圓點和周圍圓形分隔開的圖形，保留中央圓點連接至側面的連線圖形。將ito電極嵌入細胞培養池中，利用側面的連線圖形連接對電極，如此ito電極上的圖形可以對其上附壁生長的細胞阻抗信號進行檢測分析。
18、優選的，將ito電極通過激光進行刻蝕。調節高能激光束的焦點位置，使直接作用于?ito?薄膜層，使得ito層瞬間氣化，從而達到蝕刻的效果。
19、進一步，s4中，加入含有細胞的懸液，細胞將附著在ito電極上形成1-5層的密鋪，優選的加入含有細胞的懸液形成單層。控制細胞層數不超過5層，更容易為光學顯微鏡觀察，避免過多細胞堆疊造成透光率不佳，影響觀察精確。
20、進一步，s4中，將電化學生物傳感器和細胞培養池使用紫外線照射滅菌。
21、優選的，紫外線滅菌10-30min。更優選，紫外線照射滅菌15-25min。
22、進一步，s4中，加入含有細胞的懸液是加入含有肝癌細胞的懸液。
23、進一步，s4中，使細胞將附著在ito電極上形成1-2層細胞附著層。優選的，細胞將附著在ito電極上形成單層細胞，即1層細胞附著在電極表面。
24、進一步，加入含有細胞的懸液以后，加入含有待測試藥物成分的培養基，培養基的厚度是加入細胞懸液厚度的1-4倍。
25、進一步，s4中，采用熱療工藝，加入培養基的厚度是加入細胞懸液厚度的1-4倍，然后在熱療溫度進行培養。例如，設定培養參數為5%?co2，40-50℃范圍內的熱療溫度。或者設定溫度為41℃或45℃或48℃或50℃。
26、加入的培養基要提供足夠的生長所需原料成分，提供細胞生長的保障，同時要避免過厚的培養基影響光學信號檢測和電學信號檢測，如果細胞懸液的厚度（對應細胞數量）和培養基的厚度配比不在此范圍內，光學觀察結果和電學信號檢測結果難以進行復合，進而無法實現兩種檢測結果的融合分析，影響細胞凋亡率結果的分析精度。
27、進一步，加入含有待測試藥物成分的培養基，進行培養的時候，細胞培養箱設定培養參數為5%?co2、37℃。
28、進一步，s5中，使用光學平臺的顯微鏡實時觀察培養池中細胞的凋亡變化。
29、進一步，s6中，電化學工作站使用阻抗檢測法測定電阻信號變化數據，電化學生物傳感器設定測試的頻率區間為1.21hz-3.16hz。
30、進一步，s6中，以細胞覆蓋率變化和電阻變化為縱坐標做圖，按照時間軸將做圖結果所得圖像對齊。
31、基于上述技術方案，本專利技術取得了以下技術效果：
32、1、本專利技術方法相比于傳統的細胞凋亡率實驗方法能夠更好的獲得細胞凋亡率數據中的時間特性，能夠用于分析藥物濃度對于細胞造成殺滅作用的生效時間進度變化過渡情況。可用于指導藥物開發或指導臨床用藥技術的研究。
33、2、本專利技術方法中電化學生物傳感器通過現有的電化學工作站的三電極系統融合而成，充分利用現有裝置設備，搭配光學平臺本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，S4中，將電化學生物傳感器和細胞培養池使用紫外線照射滅菌。
3.根據權利要求2所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，紫外線滅菌10-30min。
4.根據權利要求3所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，S4中，加入含有細胞的懸液是加入含有肝癌細胞的懸液。
5.根據權利要求3所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，使細胞附著在ITO電極上形成1-2層細胞附著層。
6.根據權利要求5所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，細胞將附著在ITO電極上形成單層細胞。
7.根據權利要求1所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，S4中，加入含有待測試藥物成分的培養基，進行培養的時候，細胞培養箱設定培養參數為5%?CO2、37℃。
8.根據權利要求7所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，S5中，使用光學平臺的顯微鏡實時觀察培養池中細胞的凋亡變化。
9.
10.根據權利要求1所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，以細胞覆蓋率變化和電阻變化為縱坐標作圖，按照時間軸將做圖結果所得圖像對齊。
...【技術特征摘要】
1.一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，s4中，將電化學生物傳感器和細胞培養池使用紫外線照射滅菌。
3.根據權利要求2所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，紫外線滅菌10-30min。
4.根據權利要求3所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，s4中，加入含有細胞的懸液是加入含有肝癌細胞的懸液。
5.根據權利要求3所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，使細胞附著在ito電極上形成1-2層細胞附著層。
6.根據權利要求5所述一種細胞實時凋亡率檢測方法，其特征在于，細胞將附著在ito電極上形成單層細胞。...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹菲，李英，劉入銘，曾紅娟，湯麗霞，李晁瑜，曾嘉桐，
申請(專利權)人：成都醫學院第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：
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