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    一種微球與蛋白偶聯的方法技術

    技術編號:43300952 閱讀:9 留言:0更新日期:2024-11-12 16:16
    本發明專利技術涉及免疫診斷技術領域,具體涉及一種微球與蛋白偶聯的方法。本發明專利技術提供的一種微球與蛋白偶聯的方法,能夠改善標記過程中的微球的分散性,改善標記過程中的微球的團聚、沾壁現象,使微球活化、偶聯時均處于分散性良好的狀態,從而提高活化效率、偶聯效率,達到提高微球標記的抗體/抗原數量的效果,從而可以節約抗體/抗原成本,本發明專利技術的方法應用于制備檢測試劑盒時,能夠有效提高試劑的檢測靈敏度。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及免疫診斷,具體涉及一種微球與蛋白偶聯的方法


    技術介紹

    1、納米微球一般是高分子聚合而成,例如聚苯乙烯,殼聚糖、聚丙烯酸、二氧化硅等材料聚合成納米級別的微球。納米微球被廣泛應用到體外診斷試劑中,納米微球通常通過化學鍵結合、物理吸附以及生物親和等方式偶聯蛋白。其中,化學鍵結合方式主要是通過在納米微球表面修飾一些反應基團,例如羧基、羥基、醛基等,再通過活化劑,例如edc、nhs、戊二醛、nabh3cn等活化劑將反應基團活化,再與抗體/抗原上的氨基進行化學鍵結合,即微球與抗體/抗原進行偶聯,之后再用帶有特定基團的化學物質對未進行偶聯的多余結合位點進行封閉。物理吸附法是通過納米微球與蛋白之間的非特異性相互作用,如靜電吸附、疏水相互作用等,實現兩者的偶聯。生物親和法利用生物分子之間的特異性識別作用,如抗原和抗體反應、生物素和親和素系統等,實現納米微球與蛋白的偶聯。

    2、采用化學方法進行偶聯時,為了實現免疫反應后的檢測需求,納米微球中會通過包埋法、自組裝法、化學鍵合法、共聚法等方法吸附或包埋熒光染料分子、光敏劑等化學物質。而這些有機物質通常有較強疏水性,即使納米微球表面修飾有親水基團,也可能在偶聯抗體過程中因為出現團聚、沉降的現象。由于物理吸附的作用力相對較弱,在外界環境的影響下,如溫度、離子強度的變化,容易導致納米微球與蛋白的團聚。采用生物親和法中所使用的特異性生物分子,如抗體、親和素等,通常制備成本較高,這增加了整個偶聯過程的經濟成本,不適用于生產應用。


    技術實現思路

    1、有鑒于此,本專利技術要解決的技術問題在于提供一種微球與蛋白偶聯的方法,本專利技術提供的一種微球與蛋白偶聯的方法能夠改善標記過程中的微球的分散性,從而提高微球標記的抗體/抗原數量的效果。

    2、本專利技術提供了一種微球與蛋白偶聯的方法,包括如下步驟:

    3、步驟1、取微球與清洗液混合后超聲清洗;

    4、步驟2、取步驟1中清洗后的微球進行活化;

    5、步驟3、取活化后的微球與清洗液混合后,再次超聲清洗;

    6、步驟4、取步驟3中清洗后的微球與蛋白混合進行偶聯反應;

    7、步驟5、取步驟4中偶聯后的微球,經封閉,獲得微球與蛋白的偶聯物;

    8、所述清洗液包括十二烷基苯磺酸鈉和膽酸鈉。

    9、與現有技術相比,本專利技術提供的微球與蛋白偶聯的方法各步驟之間相互影響,各組分溶液之間相互配合,改善標記過程中的微球的團聚、沾壁現象,達到提高微球標記的抗體或抗原數量的目的,從而可以節約抗體或抗原成本,以達到更好的技術效果。

    10、在一些實施例中,每100ml所述清洗液中包含0.0001~0.01g十二烷基苯磺酸鈉和0.0001~0.01g膽酸鈉。

    11、與現有技術中的清洗液相比,本專利技術提供的清洗液能夠更好的改善標記過程中的微球的團聚、沾壁現象,從而獲得更準確的技術效果。上述濃度范圍的清洗液中,組分之間相互配合效果更好,兼容性更強,能夠更好的改善標記過程中的微球的團聚、沾壁現象,從而獲得更準確的技術效果。

    12、在一些具體實施例中,每100ml所述清洗液中包含0.01g十二烷基苯磺酸鈉和0.0001g膽酸鈉。

    13、在一些具體實施例中,每100ml所述清洗液中包含0.0001g十二烷基苯磺酸鈉和0.01g膽酸鈉。

    14、在一些具體實施例中,每100ml所述清洗液中包含0.005g十二烷基苯磺酸鈉和0.005g膽酸鈉。

    15、實驗表明,在上述濃度下,所述清洗液組分之間配合最好,兼容性最強,從而獲得最準確的技術效果。

    16、在一些實施例中,所述微球包括熒光微球、供體微球和受體微球中的至少一種。

    17、優選地,所述微球的原料包括聚苯乙烯、殼聚糖、聚丙烯酸和二氧化硅中的至少一種,

    18、優選地,所述微球的表面標記物包括熒光、放射性同位素、酶、生物素、抗體和化學發光基團中的至少一種。

    19、更優選地,所述微球為受體微球。

    20、在一些實施例中,所述超聲清洗后還包括將所述微球進行離心并棄上清;

    21、優選地,所述離心的速度為10000~20000rpm,所述離心的時間為10~15min;

    22、更優選地,所述離心的速度為18000rpm,所述離心的時間為15min。

    23、在一些實施例中,所述步驟2中,所述活化包括取所述微球、稀釋液和所述活化劑混合、震蕩孵育。

    24、在一些實施例中,所述活化劑包括edc、nhs、戊二醛和nabh3cn中的至少一種,所述稀釋液包括mes緩沖液、hepes緩沖液和pbs緩沖液中的至少一種。

    25、優選地,所述活化的反應溫度為25~40℃,所述震蕩孵育采用500~1000rmp孵育15~30min;

    26、所述活化的反應溫度為30℃,所述震蕩孵育采用800rmp孵育30min。

    27、在一些實施例中,所述步驟4中,所述偶聯反應包括取偶聯緩沖液懸浮所述經清洗后的微球后,與所述蛋白混合、震蕩孵育,所述偶聯緩沖液包括hepes緩沖液、pbs緩沖液和硼酸緩沖液中的至少一種,所述蛋白包括抗體或抗原;

    28、優選地,所述孵育的溶液中,所述微球的濃度為30~70%(w/v),所述蛋白的濃度為1%~30%(w/v),所述孵育的溫度為25~40℃,所述震蕩孵育采用500~1000rmp震蕩孵育2~4h;

    29、更優選地,所述孵育的溶液中,所述微球的濃度為50%(w/v),所述蛋白的濃度為30%(w/v),所述孵育的溫度為30℃,所述震蕩孵育采用800rmp震蕩孵育4h。

    30、在一些實施例中,所述步驟5中,所述封閉包括取所述微球經封閉液震蕩孵育,所述封閉液包括bsa、甘氨酸、乙醇胺、酪蛋白和羧基甲氧基胺中的至少一種;

    31、優選地,所述封閉的反應溫度為25~40℃,所述封閉采用500~1000rmp震蕩孵育15~30min;

    32、更優選地,所述封閉的反應溫度為30℃,所述封閉采用800rmp震蕩孵育30min。

    33、在一些實施例中,所述封閉后的溶液經離心、棄上清后,采用水再次超聲清洗、離心,所得沉淀與緩沖液混合保存,所述緩沖液包括tris緩沖液、hepes緩沖液和pbs緩沖液中的至少一種;

    34、優選地,所述保存的溫度為2~8℃

    35、更優選地,所述保存的溫度為4℃。

    36、實驗表明,對比現有技術中的微球和蛋白的偶聯物,采用上述方法制得的偶聯物,由于其各步驟之間相互影響效果最好,各組分溶液之間相互配合最緊密,能夠更好的改善標記過程中的微球的團聚、沾壁現象,達到更好的微球標記的抗體或抗原數量的目的,從而可以節約抗體或抗原成本,從而獲得更準確的技術效果。

    37、本專利技術提供了采用所述的方法制得的偶聯物。

    38、本專利技術提供了所述的偶聯物在制備檢測試本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    1.一種微球與蛋白偶聯的方法,其特征在于,包括如下步驟:

    2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,每100mL所述清洗液中包含0.0001~0.01g十二烷基苯磺酸鈉和0.0001~0.01g膽酸鈉。

    3.根據權利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步驟1中,所述微球包括熒光微球、供體微球和受體微球中的至少一種。

    4.根據權利要求1~3任一項所述的方法,其特征在于,所述步驟1和步驟3中,所述超聲清洗后還包括取所述微球離心并棄上清,所述離心的速度為10000~20000rpm,所述離心的時間為10~15min。

    5.根據權利要求1~4任一項所述的方法,其特征在于,所述步驟2中,所述活化包括取所述微球和所述稀釋液超聲混勻后,再加入活化劑混合、震蕩孵育。

    6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,所述活化劑包括EDC、NHS、戊二醛和NaBH3CN中的至少一種,所述稀釋液包括MES緩沖液、Hepes緩沖液和PBS緩沖液中的至少一種;

    7.根據權利要求1~6任一項所述的方法,其特征在于,所述步驟4中,所述偶聯反應包括取偶聯緩沖液懸浮所述經清洗后的微球后,與所述蛋白混合、震蕩孵育。

    8.根據權利要求7所述的方法,其特征在于,所述偶聯緩沖液包括Hepes緩沖液、PBS緩沖液和硼酸緩沖液中的至少一種,所述蛋白包括抗體或抗原;

    9.根據權利要求1~8任一項所述的方法,其特征在于,所述步驟5中,所述封閉包括取所述微球經封閉液震蕩孵育,其中,所述封閉液包括BSA、甘氨酸、乙醇胺、酪蛋白和羧基甲氧基胺中的至少一種,所述封閉的反應溫度為25~40℃,所述封閉采用500~1000rmp震蕩孵育15~30min。

    10.根據權利要求1~9任一項所述的方法,其特征在于,所述封閉后的溶液經離心、棄上清后,采用水再次超聲清洗、離心,所得沉淀與緩沖液混合保存,其中,所述緩沖液包括Tris緩沖液、Hepes緩沖液和PBS緩沖液中的至少一種,所述保存的溫度為2~8℃。

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    【技術特征摘要】

    1.一種微球與蛋白偶聯的方法,其特征在于,包括如下步驟:

    2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,每100ml所述清洗液中包含0.0001~0.01g十二烷基苯磺酸鈉和0.0001~0.01g膽酸鈉。

    3.根據權利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步驟1中,所述微球包括熒光微球、供體微球和受體微球中的至少一種。

    4.根據權利要求1~3任一項所述的方法,其特征在于,所述步驟1和步驟3中,所述超聲清洗后還包括取所述微球離心并棄上清,所述離心的速度為10000~20000rpm,所述離心的時間為10~15min。

    5.根據權利要求1~4任一項所述的方法,其特征在于,所述步驟2中,所述活化包括取所述微球和所述稀釋液超聲混勻后,再加入活化劑混合、震蕩孵育。

    6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,所述活化劑包括edc、nhs、戊二醛和nabh3cn中的至少一種,所述稀釋液包括mes緩沖液、hepes緩沖液和pbs緩...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:趙院李宗祥彭琳戴斌楊賽男
    申請(專利權)人:三諾生物傳感股份有限公司
    類型:發明
    國別省市:

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