【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及疫苗制備，更具體的說是一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(apn)引起的一種高度傳染性、致死性呼吸道病,以急性出血和慢性的纖維素性壞死性胸膜炎病變?yōu)橹饕卣鳌１静Ω鞣N豬均易感,在新引進(jìn)豬群多呈急性暴發(fā),其發(fā)病率和死亡率常在20％以上,最急性型的死亡率可高達(dá)80％～100％。常在群多呈慢性經(jīng)過,患豬表現(xiàn)慢性消瘦,或繼發(fā)其它疾病造成急性死亡。無癥狀的豬或康復(fù)豬體內(nèi)可長期帶菌,成為穩(wěn)定的傳染源。豬傳染性胸膜肺炎分布廣泛。自1957年pattison等首次報道豬傳染性胸膜肺炎以來,世界各國均發(fā)現(xiàn)有本病流行。由于本病經(jīng)空氣和接觸傳染,以致越是養(yǎng)豬集約化程度高的國家和地區(qū)發(fā)病越嚴(yán)重。
2、外膜囊泡(omvs)是革蘭氏陰性菌表面分泌的產(chǎn)物，是細(xì)菌外膜在一定的機(jī)制下發(fā)生出芽并在細(xì)菌表面形成一種囊泡狀的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)包括了外膜以及周質(zhì)成分。外膜囊泡大多數(shù)為球形，直徑大約在20–250nm之間。1959年，de等首次發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌濾除細(xì)菌后的培養(yǎng)液能夠誘導(dǎo)家兔對霍亂弧菌的免疫反應(yīng)。chatterje等在研究對數(shù)生長期霍亂弧菌的超微結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)基無菌濾液中有革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁出芽形成的囊泡，而且在外膜容易發(fā)生囊泡出芽的位點(diǎn)附近，顆粒物質(zhì)含量較高，這些顆粒可以隨著細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入出芽的囊泡中。omvs的產(chǎn)生代表著細(xì)菌具有向外部環(huán)境釋放大量的，復(fù)雜的蛋白組分和磷脂的獨(dú)特機(jī)制。后來的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的革蘭氏陰性菌都能產(chǎn)生omvs，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的組成
3、現(xiàn)外膜囊泡多使用超速離心機(jī)進(jìn)行兩次超離心來進(jìn)行提取，因超速離心機(jī)處理樣品量有限，且操作難度大、成本高，費(fèi)時費(fèi)力，不能大量提取外膜囊泡，不適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而本專利技術(shù)克服了此缺陷，本專利技術(shù)使用中空纖維濃縮系統(tǒng)對樣品進(jìn)行濃縮，可實現(xiàn)大量提取外膜囊泡，同時使用peg濃縮代替兩次超速離心，即低了成本又降低了操作難度，使外膜囊泡的大量提取及產(chǎn)業(yè)化成為可能。
4、目前，現(xiàn)階段的豬傳染性胸膜肺炎疫苗多為滅活菌疫苗，但菌株制備過程繁瑣，成本高，且免疫效果不佳。omvs具有介導(dǎo)dna片段、自溶酶、細(xì)胞毒素、毒力因子和多種生物分子轉(zhuǎn)移的特性，omvs的組成使其成為激活宿主先天和獲得性免疫應(yīng)答通路的重要因子。除了強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)分子lps外，囊泡還含有om孔蛋白和其他重要的先天免疫激活配體，omv的免疫原性可導(dǎo)致保護(hù)性黏膜和全身殺菌抗體反應(yīng)，已被用于疫苗開發(fā)。目前所有實驗證據(jù)表明，對omv的先天免疫反應(yīng)是由細(xì)菌相關(guān)分子模式(pamps)和對lps的識別共同作用的結(jié)果。囊泡中的脂蛋白和om蛋白是一種生物活性分子，可以激活免疫細(xì)胞并誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移。
5、因此如何將外膜囊泡應(yīng)用于豬傳染性胸膜肺炎疫苗，提供一種在降低滅活菌體含量的情況下，仍具有顯著預(yù)防豬傳染性胸膜肺炎效果的疫苗，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的技術(shù)問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)提供了一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物及其制備方法和應(yīng)用。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物，所述組合物由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型gz株分泌的omvs和胸膜肺炎放線桿菌7型zq株分泌的omvs組成，所述omvs是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，其攜帶有細(xì)菌外膜和周質(zhì)成分。
4、本專利技術(shù)的再一目的是提供：一種上述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物的制備方法，包括如下步驟：
5、(1)將豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型gz株、7型zq株分別發(fā)酵培養(yǎng)8-10h，制備得到1型gz株發(fā)酵菌液和7型zq株發(fā)酵菌液；
6、(2)分別將上述兩種發(fā)酵菌液離心分離，取上清液，過中空纖維系統(tǒng)濃縮，制備得到1型gz株上清濃縮液和7型zq株上清濃縮液；
7、(3)取上述兩種上清濃縮液按6-14％的量分別加入peg濃縮，靜置，離心分離，取沉淀分別加入pbs重懸、過濾，制備得到1型gz株omvs和7型zq株omvs，混合，制得豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物。
8、優(yōu)選的，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件如下：發(fā)酵溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100-200rpm、ph7.2-7.4、發(fā)酵罐壓力0.03-0.05pa、發(fā)酵時間8～10h。
9、優(yōu)選的，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為包含nad和新生牛血清的tsb培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中nad的終濃度為0.01％，新生牛血清的終濃度為2％。
10、優(yōu)選的，步驟(2)所述離心分離過程如下：2-8℃，8000rpm，離心15min；所述濃縮采用300kda中空纖維系統(tǒng)濃縮。
11、優(yōu)選的，步驟(3)所述peg的加入量為上清濃縮液總重量的6-14％，2-8℃下攪拌4h，所述靜置的時間為18-24h；離心分離過程如下：12000rpm，4℃，離心30min；所述過濾采用0.22μm濾膜過濾。
12、本專利技術(shù)的再一目的是提供：上述omvs組合物或上述方法制備的omvs組合物在制備豬傳染性胸膜肺炎疫苗或疫苗佐劑中的應(yīng)用。
13、本專利技術(shù)的再一目的是提供：一種豬傳染性胸膜肺炎二價滅活omv疫苗，所述二價滅活omv疫苗包括上述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物。
14、優(yōu)選的，所述二價滅活omv疫苗還包括豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型gz株和7型zq株的滅活菌株。
15、本專利技術(shù)的再一目的是提供：一種豬傳染性胸膜肺炎二價滅活omv疫苗的制備方法，按照下述重量份數(shù)稱取各原料，并進(jìn)行制備：
16、(1)油相制備：取注射用白油94份，先加入6份司本-80，然后邊攪拌邊加入硬脂酸鋁2份，加熱攪拌至透明，高溫高壓滅菌，制備得到油相備用；
17、(2)水相制備：根據(jù)活菌計數(shù)和外膜囊泡的bca含量檢測結(jié)果，根據(jù)需求，將豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型gz株滅活菌液、7型zq株滅活菌液和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物按不同比例混合，配制成含外膜囊泡的混合菌液取混合菌液96份，4份滅菌吐溫-80，充分混勻，制備得到水相，備用；
18、(3)乳化：取油相2份低速攪拌的同時，緩緩加水相1份，以4000rpm攪拌30min乳化成油乳劑，在終止攪拌前加入1％的硫柳汞溶液，使其在疫苗中的終濃度不超過0.01％，即制得豬傳染性胸膜肺炎二價滅活omv疫苗。
19、優(yōu)選的，步驟(2)所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型gz株菌液和7型zq株滅活菌液的濃度均≥3.2×109cfu/ml，兩菌液等量混合，組合物中兩種omvs含量均≥78.125μg/ml本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌OMVs組合物，其特征在于，所述組合物由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型GZ株分泌的OMVs和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌7型ZQ株分泌的OMVs組成，所述OMVs是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，其攜帶有細(xì)菌外膜和周質(zhì)成分。
2.一種權(quán)利要求1所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌OMVs組合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件如下：發(fā)酵溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100-200rpm、pH7.2-7.4、發(fā)酵罐壓力0.03-0.05pa、發(fā)酵時間8～10h；
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述離心分離過程如下：2-8℃，8000rpm，離心15min；所述濃縮采用300KDa中空纖維系統(tǒng)進(jìn)行濃縮；
5.權(quán)利要求1所述的OMVs組合物或權(quán)利要求2-4所述方法制備的OMVs組合物在制備豬傳染性胸膜肺炎疫苗或疫苗佐劑中的應(yīng)用。
6.一種豬傳染性胸膜肺炎二價滅活OMV疫苗，其特征在于，所述二價滅活OMV疫苗包括權(quán)利要
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬傳染性胸膜肺炎二價滅活OMV疫苗，其特征在于，還包括豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型GZ株和7型ZQ株的滅活菌株。
8.一種豬傳染性胸膜肺炎二價滅活OMV疫苗的制備方法，其特征在于，按照下述重量份數(shù)稱取各原料，并進(jìn)行制備：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型GZ株菌液和7型ZQ株滅活菌液的濃度均≥3.2×109CFU/mL，兩菌液等量混合，組合物中兩種OMVs含量均≥78.125μg/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述豬傳染性胸膜肺炎二價滅活OMV疫苗中豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型GZ株和7型ZQ株外膜囊泡的濃度均為25μg/ml。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物，其特征在于，所述組合物由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型gz株分泌的omvs和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌7型zq株分泌的omvs組成，所述omvs是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，其攜帶有細(xì)菌外膜和周質(zhì)成分。
2.一種權(quán)利要求1所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌omvs組合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件如下：發(fā)酵溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速100-200rpm、ph7.2-7.4、發(fā)酵罐壓力0.03-0.05pa、發(fā)酵時間8～10h；
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述離心分離過程如下：2-8℃，8000rpm，離心15min；所述濃縮采用300kda中空纖維系統(tǒng)進(jìn)行濃縮；
5.權(quán)利要求1所述的omvs組合物或權(quán)利要求2-4所述方法制備的omvs組合物在制備豬傳染性胸膜肺炎...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李劼，張立華，李超，張利平，楊富貴，史文瑞，徐麗，
申請(專利權(quán))人：金宇保靈生物藥品有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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