【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
技術介紹
1、本領域需要修飾性多核苷酸以改善生物體的表型和基因型；特別是用于農業應用以改良植物，例如農作物。
2、分體病毒(pv)是具有分開衣殼化的二分基因組的dsrna病毒。一個(pv)基因組包含編碼rna依賴性rna聚合酶的dsrna，并且另一個pv基因組包含編碼衣殼蛋白的dsrna(roossinck,m.doi/10.1111/nph.15364)。
技術實現思路
1、提供了包含第一啟動子的重組dna分子，所述第一啟動子與編碼rna分子的dna可操作地連接，其中所述rna分子從5’末端至3’末端包含：(a)由分體病毒rna依賴性rna聚合酶(rdrp)識別的5’rna復制元件；(b)貨物rna分子；以及(c)由所述rdrp識別的3’rna復制元件；其中所述5’rna復制元件、所述貨物rna分子和所述3’rna復制元件可操作地連接，其中所述啟動子和所述貨物rna分子與所述5’rna復制元件和所述3’rna復制元件是異源的。還提供了細胞，載體，以及包含重組dna分子、載體或細胞的農業配制品。還提供了表達系統，其包含重組dna分子和含有所述重組dna分子和識別由dna分子編碼的5’和3’rna復制元件的rdrp蛋白的細胞。還提供了向植物提供合成的分體病毒衛星rna的方法，所述方法包括使所述植物與重組dna分子、細胞、載體或其農業配制品接觸。提供了在植物或植物細胞中產生外源多肽的方法，所述方法包括提供包含重組dna分子的植物或植物細胞，其中由所述dna分子編碼的貨物r
2、還提供了重組rna分子，其從5’末端至3’末端包含：(a)由分體病毒rna依賴性rna聚合酶(rdrp)識別的5’rna復制元件；(b)貨物rna分子；以及(c)由所述rdrp識別的3’rna復制元件，其中所述5’rna復制元件、所述貨物rna分子和所述3’rna復制元件可操作地連接，并且其中所述貨物rna分子與所述5’rna復制元件和所述3’rna復制元件是異源的。還提供了包含重組rna分子的農業配制品和細胞。還提供了表達系統，其包含：(a)含有所述重組rna分子的rna分子；以及(b)含有所述重組rna分子和識別所述重組rna分子的5’和3’rna復制元件的rdrp蛋白的細胞。提供了包含重組rna分子和分體病毒rdrp的植物繁殖體。提供了包含含有重組rna分子和分體病毒rdrp的至少一個植物細胞的植物繁殖體。提供了產生經修飾的植物繁殖體的方法，所述植物繁殖體包含含有所述重組rna分子的至少一個植物細胞，所述方法包括從包含含有所述重組rna分子的植物細胞和缺乏所述重組rna分子的植物細胞的植物細胞混合群體中分離包含含有所述重組rna分子和分體病毒rna依賴性rna聚合酶(rdrp)的至少一個植物細胞的植物繁殖體。還提供了向植物提供合成的分體病毒衛星rna的方法，所述方法包括使所述植物與重組rna分子接觸。提供了獲得植物或植物細胞中的表型變化的方法，所述方法包括向植物或植物細胞提供重組rna分子，其中所述貨物rna分子包含在所述植物或植物細胞中與缺乏所述重組rna的植物或植物細胞相比實現表型變化的rna，其中所述植物或植物細胞包含識別所述5’rna復制元件和3’rna復制元件并且催化合成的分體病毒rna從所述重組rna分子的合成的rdrp蛋白，并且所述貨物rna分子實現所述表型變化。提供了增加植物對有害生物或病原體的抗性的方法，所述方法包括向植物提供重組rna分子，其中所述貨物rna分子實現與缺乏所述重組rna分子的植物相比所述植物對有害生物或病原體的抗性的增加，并且其中所述植物或植物細胞包含識別所述重組rna的5’rna復制元件和3’rna復制元件并且催化合成的分體病毒衛星rna從重組rna分子的合成的rdrp蛋白。提供了增加植物對脅迫的抗性的方法，所述方法包括向植物提供重組rna分子，其中所述植物包含識別所述重組rna的5’rna復制元件和3’rna復制元件并且催化合成的分體病毒衛星rna從重組rna分子的合成的rdrp蛋白，并且其中所述貨物rna分子實現與缺乏所述重組rna分子的植物相比所述植物對脅迫的抗性的增加。提供了制造合成的分體病毒衛星顆粒的方法，所述方法包括：(a)向植物細胞提供前述重組rna分子中的至少一個，其中所述重組rna分子包含衣殼化識別元件(ere)，并且其中所述植物細胞包含rdrp蛋白和病毒衣殼蛋白，所述rdrp蛋白識別所述5’rna復制元件和3’rna復制元件并且催化合成的分體病毒衛星rna從所述重組rna分子的合成，其中所述ere提供病毒衣殼蛋白對所述rna的衣殼化；以及任選地(b)從所述植物細胞、包含所述植物細胞的植物、或從所述植物細胞或所述植物在其中生長的培養基中分離所述合成的分體病毒衛星顆粒。還提供了制造合成的分體病毒衛星顆粒的方法，所述方法包括在容器中將前述重組rna分子與病毒衣殼蛋白組合，其中所述重組rna分子包含衣殼化識別元件(ere)，并且其中所述ere在所述容器中提供所述病毒衣殼蛋白對所述rna的衣殼化；任選地其中所述方法進一步包括從所述容器中的未組合的rna和/或病毒衣殼蛋白中分離所述合成的分體病毒衛星顆粒。提供了向植物提供合成的分體病毒衛星rna的方法，所述方法包括：將接穗嫁接到包含重組rna分子的砧木上，其中所述砧木和/或所述接穗中的至少一個細胞包含分體病毒rdrp。提供了用于產生將重組rna分子傳遞到子代植物或種子的植物的方法，所述方法包括從獲得自包含所述重組rna分子的親本植物的f1植物或種子的群體中分離包含含有分體病毒rna依賴性rna聚合酶(rdrp)和所述重組rna分子的至少一個細胞的f1子代植物或種子。
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1.一種重組RNA分子，其從5’末端至3’末端包含：
2.如權利要求1所述的重組RNA分子，其中：
3.如權利要求1所述的重組RNA分子，其中：
4.如權利要求3所述的重組RNA分子，其中所述RNA二級結構通過以下來維持：用將不會堿基配對的核苷酸取代所述二級結構中未堿基配對的核苷酸和/或用將會堿基配對的核苷酸取代所述二級結構中堿基配對的核苷酸。
5.如權利要求1所述的重組RNA分子，其中：
6.如權利要求1所述的重組RNA分子，其中所述RNA分子進一步包含以下中的至少一個：(i)tRNA樣元件，任選地其中所述tRNA樣元件提供所述RNA的細胞間移動，并且任選地其中所述細胞間移動由病毒移動蛋白(MP)介導；(ii)衣殼化識別元件(ERE)，任選地其中所述ERE通過分體病毒衣殼蛋白提供所述RNA的衣殼化，或任選地其中所述ERE通過非分體病毒衣殼蛋白提供所述RNA的衣殼化；(iii)RNA效應子；和/或(iv)編碼病毒移動蛋白(MP)的RNA，任選地其中內部核糖體進入位點(IRES)與所述編碼MP的RNA可操作地連接。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種重組rna分子，其從5’末端至3’末端包含：
2.如權利要求1所述的重組rna分子，其中：
3.如權利要求1所述的重組rna分子，其中：
4.如權利要求3所述的重組rna分子，其中所述rna二級結構通過以下來維持：用將不會堿基配對的核苷酸取代所述二級結構中未堿基配對的核苷酸和/或用將會堿基配對的核苷酸取代所述二級結構中堿基配對的核苷酸。
5.如權利要求1所述的重組rna分子，其中：
6.如權利要求1所述的重組rna分子，其中所述rna分子進一步包含以下中的至少一個：(i)trna樣元件，任選地其中所述trna樣元件提供所述rna的細胞間移動，并且任選地其中所述細胞間移動由病毒移動蛋白(mp)介導；(ii)衣殼化識別元件(ere)，任選地其中所述ere通過分體病毒衣殼蛋白提供所述rna的衣殼化，或任選地其中所述ere通過非分體病毒衣殼蛋白提供所述rna的衣殼化；(iii)rna效應子；和/或(iv)編碼病毒移動蛋白(mp)的rna，任選地其中內部核糖體進入位點(ires)與所述編碼mp的rna可操作地連接。
7.如權利要求6所述的重組rna分子，其中所述trna樣元件包含來自擬南芥ft?mrna的trna樣分子，或是選自seq?id?no:184–231的trna樣序列，或是與選自由seq?id?no:184–231組成的組的支架trna樣序列具有至少90％序列同一性并且維持所述支架trna樣序列的二級結構的經修飾的trna樣序列，并且/或者其中所述ere是煙草花葉病毒(tmv)oas。
8.如權利要求1所述的重組rna分子，其中所述貨物rna分子的長度高達約3.2kb。
9.如權利要求1所述的重組rna分子，其中所述貨物rna分子包含：(a)至少一個編碼序列，任選地其中所述編碼序列編碼可選擇或可評分標志物；(b)至少一個非編碼序列；或(c)至少一個編碼序列和至少一個非編碼序列兩者。
10.如權利要求24所述的重組rna分子，其中所述貨物rna分子包含至少一個編碼序列，并且其中所述rna分子進一步包含與至少一個編碼序列可操作地連接的內部核糖體進入位點(ires)，任選地其中所述可操作地連接的ires位于所述編碼序列的5’并且與其緊鄰。
11.如權利要求24所述的重組rna分子，其中所述貨物rna分子包含至少一個非編碼序列，并且其中所述至少一個非編碼序列是發夾rna(hprna)；形成多個莖環的rna；rna假結；形成至少部分雙鏈rna的rna分子；小干擾rna(sirna)或sirna前體；微小rna(mirna)或mirna前體；分階段的rna或分階段的rna前體；核酶；配體響應性核酶(適體酶)；rna適體；或長非編碼rna(lncrna)。
12.如權利要求1所述的重組rna分子，其進一步包含含有編碼至少一個核酶的rna，任選地其中所述至少一個核酶位于所述5’rna復制元件的5’或所述3’rna復制元件的3’。
13.如權利要求1所述的重組rna分子，其進一步包含含有至少一個配體響應性核酶(適體酶)的rna分子，任選地其中所述至少一個配體響應性核酶位于所述5’rna復制元件的5’或所述3’rna復制元件的3’。
14.如權利要求1所述的重組rna分子，其中：(i)所述rna進一步包含其反向互補rna分子的至少一個區段；和/或(ii)所述重組rna分子與一種或多種rna結合蛋白復合或者被病毒衣殼蛋白衣殼化，任選地其中所述病毒衣殼蛋白是分體病毒衣殼蛋白，任選地其中所述rna包含提供所述分體病毒衣殼蛋白對所述rna的衣殼化的ere，并且/或者任選地其中所述rna結合蛋白包含rna識別基序。
15.一種農業配制品，其包含如權利要求1至14中任一項所述的重組rna分子。
16.如權利要求15所述的農業配制品，其中所述重組rna分子與一種或多種rna結合蛋白復合或者被病毒衣殼蛋白衣殼化，任選地其中所述病毒衣殼蛋白是分體病毒衣殼蛋白，并且任選地其中所述rna包含提供所述分體病毒衣殼蛋白對所述rna的衣殼化的ere。
17.如權利要求15所述的農業配制品，其中所述rna結合蛋白包含rna識別基序。
18.如權利要求15所述的農業配制品，其中所述病毒衣殼蛋白與所述分體病毒是異源的。
19.如權利要求15所述的農業配制品，其中所述配制品包含所述重組rna分子和載劑、賦形劑和/或佐劑。
20.一種細胞，其包含如權利要求1至14中任一項所述的重組rna分子。
21.如權利要求20所述的細胞，其中所述細胞是細菌細胞、真菌細胞、植物細胞或動物細胞。
22.如權利要求20所述的細胞，其中所述細胞包含編碼所述重組rna分子的重組dna分子。
23.一種表達系統，其包含：
24.如權利要求23所述的表達系統，其中所述重組rna分子包含由病毒衣殼蛋白識別的可操作地連接的衣殼化識別元件(ere)，并且其中所述細胞含有所述病毒衣殼蛋白。
25.如權利要求23所述的表達系統，其中所述衣殼化識別元件(ere)是分體病毒ere，其中所述細胞中的所述病毒衣殼蛋白是分體病毒衣殼蛋白，并且其中所述rna分子被所述分體病毒衣殼蛋白衣殼化。
26.如權利要求23所述的表達系統，其進一步包含所述重組rna分子的反向互補序列。
27.如權利要求23所述的表達系統，其中所述細胞是細菌細胞、植物細胞、真菌細胞或動物細胞。
28.如權利要求23所述的表達系統，其中所述細胞進一步包含：(i)病毒衣殼蛋白(cp)；(ii)可以與所述rna分子結合的rna結合蛋白(rbp)，任選地其中所述rbp與rna效應子結合；(iii)切割所述rna分子的rna切割劑；(iv)識別所述rna分子中的rna啟動子的rna啟動子依賴性rna聚合酶(rpdrp)蛋白；和/或(iv)病毒移動蛋白(mp)。
29.如權利要求28所述的表達系統，其中所述cp、rbp、rpdrp和/或所述mp：(a)由所述細胞中的重組dna分子表達；(b)外源地提供給所述細胞；(c)由所述細胞中的重組rna分子表達；或(d)由所述細胞中的病毒表達。
30.如權利要求28所述的表達系統，其中所述rdrp、cp、rbp、rpdrp和/或所述mp蛋白與所述細胞是異源的。
31.如權利要求23所述的表達系統，其中所述rdrp蛋白或編碼所述rdrp蛋白的多核苷酸(a)由所述細胞中的重組dna分子表達；(b)外源地提供給所述細胞；(c)由所述細胞中的重組rna分子表達；或(d)由所述細胞中的病毒表達。
32.如權利要求23所述的表達系統，其中所述細胞是植物細胞。
33.如權利要求32所述的表達系統，其中所述植物細胞含有分體病毒，所述分體病毒表達識別所述5’rna復制元件和所述3’rna復制元件的所述rdrp蛋白。
34.如權利要求33所述的表達系統，其中所述分體病毒天然存在于所述植物細胞中。
35.一種向植物提供合成的分體病毒衛星rna的方法，所述方法包括使所述植物與如權利要求1至14中任一項所述的重組rna分子接觸。
36.如權利要求35所述的方法，其中接觸包括用所述重組rna分子或所述配制品噴霧、噴粉、注射或浸泡。
37.一種在植物細胞中建立合成的分體病毒衛星rna的方法，所述方法包括：向植物細胞提供如權利要求1至14中任一項所述的重組rna分子；
38.如權利要求37所述的方法，其中所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：阿爾瓊·德揚·哈克哈，巴里·安德魯·馬丁，牛雅杰，丹尼爾·亞歷山大·斯普拉格，伊麗莎白·簡·安東內利·丹尼斯，梅米特·阿里·哈拉克，郝雨濛，詹姆斯·邁克爾·克雷默，杰雅詩麗·庫馬爾，林建元，米奇卡·加布里埃爾·夏普，阿迪亞·蘇希爾·庫馬爾·辛格，富池·陳，
申請(專利權)人：旗艦創業創新七公司，
類型：發明
國別省市：
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