【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物制藥及醫(yī)藥化工，尤其涉及一種重組菌的構(gòu)建及其制備醋酸潑尼松的方法。
技術(shù)介紹
1、甾體類藥物是指分子結(jié)構(gòu)中含有典型甾體結(jié)構(gòu)的藥物，主要包括腎上腺皮質(zhì)激素、性激素和蛋白同化激素三大類，作為目前臨床上用量僅次于抗生素的第二類藥物，全球年產(chǎn)量已超過100萬噸。甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化是指利用微生物細(xì)胞或者其體內(nèi)的酶選擇性地修飾或改造甾體化合物的某一特定部分(基團(tuán))，從而獲得結(jié)構(gòu)上類似但生理活性提高的化合物或中間體。
2、醋酸潑尼松(分子式c23h28o6，化學(xué)名為：17α,21-二羥基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮-21-醋酸酯)是一類重要的腎上腺皮質(zhì)激素類藥，具有影響糖代謝、抗炎、抗過敏、抗毒性等作用。主要生產(chǎn)工藝是：先將含有重組ksdd5酶的菌體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，再以醋酸可的松為底物，添加發(fā)酵離心所得的菌體并以細(xì)胞內(nèi)的輔酶fad作為電子受體，額外添加的pms作為電子傳遞鏈組分進(jìn)行c1、c2位脫氫后得到醋酸潑尼松，其技術(shù)路線如下：
3、
4、專利號為cn114807286a的專利技術(shù)專利公開了一種基于靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化精制醋酸潑尼松的方法，該方法使用靜息細(xì)胞進(jìn)行醋酸潑尼松的制備，但底物投料量低，僅為20-40g/l，而且轉(zhuǎn)化時間較長，需要轉(zhuǎn)化2～3d。為此需要一種能在高底物投料量，低酶用量，轉(zhuǎn)化時間短的高效率方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)提出了一種高底物投料量，低酶用量，轉(zhuǎn)化時間短的重組菌的構(gòu)建及其制備醋酸潑尼松的方
2、本專利技術(shù)的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一方面，本專利技術(shù)提供了一種重組菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
3、s1，擴增sumo蛋白基因和ksdd5蛋白酶基因，然后將pet28a質(zhì)粒酶切后與sumo基因和ksdd5基因無縫連接，獲得重組質(zhì)粒pet28a-sumo-ksdd5；
4、s2，將重組質(zhì)粒pet28a-sumo-ksdd5轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后得到重組菌。
5、本專利技術(shù)將sumo基因與ksdd5連接于pet28a(+)質(zhì)粒上，得到重組脫氫酶質(zhì)粒，隨后進(jìn)行融合表達(dá)，可利用細(xì)胞本身的fad輔酶再生體系，無需添加外源性的輔酶fad；此外sumo蛋白提高了3-甾酮-δ1-脫氫酶在大腸桿菌bl21(de3)中的溶解性，以及3-甾酮-δ1-脫氫酶在大腸桿菌bl21(de3)中的蛋白表達(dá)量，同時也提高了3-甾酮-δ1-脫氫酶ksdd5轉(zhuǎn)化醋酸潑尼松的效率。
6、另一方面，本專利技術(shù)還提供了一種重組菌，重組菌采用上述方法構(gòu)建得到，所述重組質(zhì)粒pet28a-sumo-ksdd5中編碼sumo-ksdd5融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
7、再一方面，本專利技術(shù)還提供了一種重組菌在制備醋酸潑尼松中的應(yīng)用，包括以下步驟：
8、s21，重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、離心后得到重組菌菌泥；
9、s22，將醋酸可的松乳化后，加入異丙醇、pms和步驟s21的重組菌菌泥，轉(zhuǎn)化24h得到醋酸潑尼松。
10、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，所述醋酸可的松∶重組菌菌泥的質(zhì)量比為1-4∶1。
11、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，步驟s22中轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為：溫度30℃，轉(zhuǎn)速200-400r/min，通氣量0.3-0.8vvm，壓力0.01-0.05mpa。
12、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，步驟s21中重組菌發(fā)酵培養(yǎng)方法為：重組菌二級培養(yǎng)后接種于含有卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃-37℃、轉(zhuǎn)速600-800r/min、通氣量2-3vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)ph降低到最低值并開始反彈8％-12％時開始添加補料培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液od600值20-25時，加入0.4-0.5mm?iptg誘導(dǎo)表達(dá)16-18h后離心，獲得重組菌菌泥。
13、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：甘油4-6g/l、酵母浸粉20-28g/l、胰蛋白胨15-20g/l、卡那霉素45-55μg/ml、磷酸二氫鉀1-3g/l、磷酸氫二鉀15-18g/l和消泡劑a2010.1v％-0.3v％。
14、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，補料培養(yǎng)基的組分為甘油55v％-65v％、磷酸氫二胺4-6g/l。
15、在重組菌高密度發(fā)酵過程中，隨著細(xì)胞的增殖，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分逐漸消耗。補料培養(yǎng)基能夠在細(xì)胞生長的后期及時補充消耗的養(yǎng)分，有助于延長細(xì)胞的生長階段，使其維持在高活性狀態(tài)。合理的補料還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，推動更多前體物質(zhì)的合成，增強目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生成。
16、補料培養(yǎng)基中的成分，如甘油和磷酸氫二胺為細(xì)胞提供了額外的碳源和氮源，能夠增強細(xì)胞的代謝活性。這一增加的代謝活性對后續(xù)的目標(biāo)蛋白表達(dá)、酶促反應(yīng)和底物轉(zhuǎn)化的效率都是十分重要的。更好的營養(yǎng)供給能夠提高細(xì)胞的酶活性，確保在靜息細(xì)胞酶促反應(yīng)中，細(xì)胞能夠高效地催化目標(biāo)產(chǎn)物的合成，提升醋酸潑尼松的轉(zhuǎn)化率。
17、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，步驟s22中，醋酸可的松乳化時加入助溶劑，在8000-12000r/min條件下勻漿10-15min得到乳化后醋酸可的松，微粒粒徑＜90μm。
18、在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選的，所述助溶劑為異丙醇，異丙醇的濃度為5v％-10v％。
19、醋酸可的松乳化時加入異丙醇助溶劑，可以增加醋酸可的松在水中的溶解度，還可以減少乳化過程中的界面張力，提高乳化效果，這使得醋酸可的松和重組菌之間形成更大的接觸面積，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。在生物轉(zhuǎn)化過程中，酶與底物的相互作用受到溶劑環(huán)境的影響，異丙醇則在一定程度上改善了酶的活性或穩(wěn)定性，增強了重組菌的催化能力，從而提高了最終產(chǎn)物醋酸潑尼松的轉(zhuǎn)化率。
20、本專利技術(shù)的一種重組菌的構(gòu)建及其制備醋酸潑尼松的方法相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果：
21、(1)本專利技術(shù)構(gòu)建的重組菌在轉(zhuǎn)化醋酸潑尼松時，可利用細(xì)胞本身的fad輔酶再生體系，反應(yīng)體系無需添加外源性的輔酶fad，同時也提高了轉(zhuǎn)化醋酸潑尼松的效率。
22、(2)高密度發(fā)酵過程中，追加補料培養(yǎng)基，它不僅能通過提高細(xì)胞的代謝活性、避免營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的抑制，還能增加最終的轉(zhuǎn)化率。
23、(3)異丙醇助溶劑可以增加醋酸可的松在水中的溶解度，提高醋酸可的松的乳化效果，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。此外，異丙醇在一定程度上增強了重組菌的催化能力，提高了醋酸潑尼松的轉(zhuǎn)化率。
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1.一種重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建得到的重組菌，其特征在于：重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-KsdD5中編碼SUMO-KsdD5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的重組菌在制備醋酸潑尼松中的應(yīng)用，其特征在于：包括以下步驟：
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述醋酸可的松∶重組菌菌泥的質(zhì)量比為1-4∶1。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟S22中轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為：溫度30℃，轉(zhuǎn)速200-400r/min，通氣量0.3-0.8vvm，壓力0.01-0.05MPa。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟S21中重組菌發(fā)酵培養(yǎng)方法為：重組菌二級培養(yǎng)后接種于含有卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃-37℃、轉(zhuǎn)速600-800r/min、通氣量2-3vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)pH降低到最低值并開始反彈8％-12％時開始添加補料培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液OD600值20-25時，加入0.4-0.5mM?IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16-18h后離心
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：甘油4-6g/L、酵母浸粉20-28g/L、胰蛋白胨15-20g/L、卡那霉素45-55μg/mL、磷酸二氫鉀1-3g/L、磷酸氫二鉀15-18g/L和消泡劑A2010.1v％-0.3v％。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：補料培養(yǎng)基的組分為甘油55v％-65v％、磷酸氫二胺4-6g/L。
9.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟S22中，醋酸可的松乳化時加入助溶劑，在8000-12000r/min條件下勻漿10-15min得到乳化后醋酸可的松，微粒粒徑＜90μm。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述助溶劑為異丙醇，異丙醇的濃度為5v％-10v％。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建得到的重組菌，其特征在于：重組質(zhì)粒pet28a-sumo-ksdd5中編碼sumo-ksdd5融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的重組菌在制備醋酸潑尼松中的應(yīng)用，其特征在于：包括以下步驟：
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述醋酸可的松∶重組菌菌泥的質(zhì)量比為1-4∶1。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟s22中轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為：溫度30℃，轉(zhuǎn)速200-400r/min，通氣量0.3-0.8vvm，壓力0.01-0.05mpa。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟s21中重組菌發(fā)酵培養(yǎng)方法為：重組菌二級培養(yǎng)后接種于含有卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃-37℃、轉(zhuǎn)速600-800r/min、通氣量2-3vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)ph降低到...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張蓉，羅欣然，徐子捷，王小俊，系祖斌，李明磊，姚立成，
申請(專利權(quán))人：湖北共同甾體藥物研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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