【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程領域。具體而言，本專利技術涉及一種可作用于dna的腺苷脫氨酶及其應用。更具體而言，本專利技術提供了可以作用于dna腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的腺苷脫氨酶，基于該腺苷脫氨酶的腺嘌呤堿基編輯系統及其應用。使用該堿基編輯系統對生物體基因組中的靶序列進行堿基編輯的方法，以及通過所述方法產生的經遺傳修飾的生物體及其后代。
技術介紹
1、堿基編輯(base?editing)是指通過基因工程手段對特定dna位點進行核苷酸替換的過程，堿基編輯是基因編輯(genome?editing)技術的一種。在植物中，許多優良的農藝性狀是由單核苷酸變異(single?nucleotide?variation，snv)產生的；在人體和動物中，許多遺傳疾病是由功能基因上的點突變引起的。堿基編輯技術，可以對動植物、微生物的基因組dna進行靶向修飾和改造，以創制新的基因型并獲得有益于生產應用的目標性狀，也可在遺傳疾病治療中被用于糾正一些嚴重的先天性遺傳變異，因而堿基編輯在優良種質創制和疾病治療中具有重要的應用前景。
2、腺嘌呤堿基編輯器(adenine?base?editor，abe)是最重要的堿基編輯系統之一。2017年，abe堿基編輯系統被首次報道并成功在哺乳動物細胞中實現高效的堿基編輯(gaudelli,n.m.et?al.programmable?base?editing?of?a*t?to?g*c?in?genomic?dnawithout?dna?cleavage.nature?551,464-471(2017).)。該系統包
3、abe堿基編輯的關鍵在于使用能夠作用于dna的腺苷脫氨酶。然而，天然的腺苷脫氨酶的作用底物是rna而非dna，因此無法對dna進行脫氨。為了解決這個問題，研究人員以來源于大腸桿菌的trna腺苷脫氨酶tada為底盤蛋白，進行多輪的蛋白質進化，最終獲得了能夠作用于dna的腺苷脫氨酶tada*7.10，并實現了a-t堿基對向g-c堿基對的轉換。雖然研究人員在tada*7.10基礎上又引入了一些新的氨基酸突變，獲得了一些新的有效突變體，如tada-8e，tada-8s等。但這些腺苷脫氨酶仍然是源于大腸桿菌的trna脫氨酶。
4、自2017年abe系統被首次報道以來，領域內使用的腺苷脫氨酶均基于大腸桿菌tada，尚無其他可用的dna的腺苷脫氨酶底盤被報道。因此，尋找可以作用于dna的腺苷脫氨酶底盤，對于擴充現有的腺苷堿基編輯系統、開發精確操作目標dna序列的基因編輯工具具有極其重要的意義。
技術實現思路
1、為解決目前腺苷脫氨酶類型單一、應用場景有限、編輯效率低等問題，本申請專利技術人經過大量實驗和探索，出人意料地發現了新型的腺苷脫氨酶，上述脫氨酶可作用于dna中的腺苷。基于這一發現，專利技術人開發出新型的腺嘌呤堿基編輯器，豐富了腺嘌呤堿基編輯器的應用場景和選擇。
2、用于解決問題的方案
3、在本專利技術的第一方面中，提供了一種腺苷脫氨酶，所述腺苷脫氨酶能夠使dna中腺嘌呤堿基脫氨基，所述腺苷脫氨酶選自以下(i)～(iii)中的一種或多種：
4、(i)包含與seq?id?no:4所示的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且其保留如seqid?no:4所示的氨基酸序列的脫氨活性；
5、(ii)包含在seq?id?no:4所示的氨基酸序列的c端增加連續的氨基酸的氨基酸序列，并且其保留如seq?id?no:4所示的氨基酸序列的脫氨活性；或
6、(iii)包含任意兩個以上如(i)或(ii)中所述的氨基酸序列構成的多聚體。
7、在一些實施方案中，在(ii)中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4的c端增加至少8個連續的氨基酸的氨基酸序列。
8、在一些實施方案中，在(ii)中，所述腺苷脫氨酶包含如seq?id?no:5所示的氨基酸序列。
9、在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列，并保留如seq?idno:4所示的氨基酸序列的脫氨活性。
10、在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有w71x突變的氨基酸序列，其中x是除w(色氨酸)之外的任何氨基酸，優選的，x是y(酪氨酸)。
11、在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有a91x突變的氨基酸序列，其中x是除a(丙氨酸)之外的任何氨基酸。在一些具體的實施方案中，x是t(蘇氨酸)。
12、在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有v80x突變的氨基酸序列，其中x是除v(纈氨酸)之外的任何氨基酸。在一些具體的實施方案中，x是t(蘇氨酸)。
13、在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有s122x突變的氨基酸序列，其中x是除s(絲氨酸)之外的任何氨基酸。在一些具體的實施方案中，x是g(甘氨酸)。
14、在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含選自在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有w71y突變、a91t突變、v80t突變和s122t突變中的一個或多個突變的氨基酸序列。
15、在一些實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有w71y突變和另一種腺嘌呤脫氨酶的突變的氨基酸序列。
16、在一些具體的實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有w71y和a91t突變的氨基酸序列。
17、在一些具體的實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有w71y和v80t突變的氨基酸序列。
18、在一些具體的實施方案中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有w71y和s122t突變的氨基酸序列。
19、在一些實施方案中，在(iii)中，所述多聚體包含任意兩個如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列構成的二聚體，所述任意兩個如(i)和(ii)中所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種腺苷脫氨酶，所述腺苷脫氨酶能夠使DNA中腺嘌呤堿基脫氨基，所述腺苷脫氨酶選自以下(i)～(iii)中的一種或多種：
2.根據權利要求1所述的腺苷脫氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQ?IDNO:4的C端增加至少8個連續的氨基酸的氨基酸序列。
3.根據權利要求2所述的腺苷脫氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脫氨酶包含如SEQ?IDNO:5所示的氨基酸序列。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQ?IDNO:4或SEQ?ID?NO:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列，并保留如SEQ?ID?NO:4所示的氨基酸序列的脫氨活性。
5.根據權要求4所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQ?ID?NO:4或SEQID?NO:5中具有W71X突變的氨基酸序列，其中X是除W(色氨酸)之外的任何氨基酸，優選的，X是Y(酪氨酸)。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQ?IDNO:4或
7.根據權利要求6所述的腺苷脫氨酶，其中，X是T(蘇氨酸)。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQ?IDNO:4或SEQ?ID?NO:5中具有V80X突變的氨基酸序列，其中X是除V(纈氨酸)之外的任何氨基酸。
9.根據權利要求8所述的腺苷脫氨酶，其中，X是T(蘇氨酸)。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQID?NO:4或SEQ?ID?NO:5中具有S122X突變的氨基酸序列，其中X是除S(絲氨酸)之外的任何氨基酸。
11.根據權利要求10所述的腺苷脫氨酶，其中，X是G(甘氨酸)。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含選自在SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:5中具有W71Y突變、A91T突變、V80T突變和S122T突變中的一個或多個突變的氨基酸序列。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQID?NO:4或SEQ?ID?NO:5中具有W71Y突變和另一種腺嘌呤脫氨酶的突變的氨基酸序列。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQID?NO:4或SEQ?ID?NO:5中具有W71Y和A91T突變的氨基酸序列。
15.根據權利要求1-13中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQID?NO:4或SEQ?ID?NO:5中具有W71Y和V80T突變的氨基酸序列。
16.根據權利要求1-13中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在SEQID?NO:4或SEQ?ID?NO:5中具有W71Y和S122T突變的氨基酸序列。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，在(iii)中，所述多聚體包含任意兩個如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列構成的二聚體，所述任意兩個如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列通過接頭連接。
18.根據權利要求17所述的腺苷脫氨酶，其中，所述接頭包含如SEQ?ID?NO:30所示的氨基酸序列。
19.根據權利要求1-18中任一項所述的腺苷脫氨酶用于在生物體或生物體細胞中進行基因編輯中的用途，或者在制備用于在生物體或生物體細胞中進行基因編輯的試劑中的用途。
20.一種融合蛋白，其包含：
21.根據權利要求20所述的融合蛋白，其中，所述核酸靶向結構域為TALE、ZFP或CRISPR效應蛋白結構域。
22.根據權利要求21所述的融合蛋白，其中，所述CRISPR效應蛋白選自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cm...
【技術特征摘要】
1.一種腺苷脫氨酶，所述腺苷脫氨酶能夠使dna中腺嘌呤堿基脫氨基，所述腺苷脫氨酶選自以下(i)～(iii)中的一種或多種：
2.根據權利要求1所述的腺苷脫氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?idno:4的c端增加至少8個連續的氨基酸的氨基酸序列。
3.根據權利要求2所述的腺苷脫氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脫氨酶包含如seq?idno:5所示的氨基酸序列。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?idno:4或seq?id?no:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列，并保留如seq?id?no:4所示的氨基酸序列的脫氨活性。
5.根據權要求4所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?id?no:4或seqid?no:5中具有w71x突變的氨基酸序列，其中x是除w(色氨酸)之外的任何氨基酸，優選的，x是y(酪氨酸)。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?idno:4或seq?id?no:5中具有a91x突變的氨基酸序列，其中x是除a(丙氨酸)之外的任何氨基酸。
7.根據權利要求6所述的腺苷脫氨酶，其中，x是t(蘇氨酸)。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seq?idno:4或seq?id?no:5中具有v80x突變的氨基酸序列，其中x是除v(纈氨酸)之外的任何氨基酸。
9.根據權利要求8所述的腺苷脫氨酶，其中，x是t(蘇氨酸)。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seqid?no:4或seq?id?no:5中具有s122x突變的氨基酸序列，其中x是除s(絲氨酸)之外的任何氨基酸。
11.根據權利要求10所述的腺苷脫氨酶，其中，x是g(甘氨酸)。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含選自在seq?id?no:4或seq?id?no:5中具有w71y突變、a91t突變、v80t突變和s122t突變中的一個或多個突變的氨基酸序列。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seqid?no:4或seq?id?no:5中具有w71y突變和另一種腺嘌呤脫氨酶的突變的氨基酸序列。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seqid?no:4或seq?id?no:5中具有w71y和a91t突變的氨基酸序列。
15.根據權利要求1-13中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seqid?no:4或seq?id?no:5中具有w71y和v80t突變的氨基酸序列。
16.根據權利要求1-13中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，所述腺苷脫氨酶包含在seqid?no:4或seq?id?no:5中具有w71y和s122t突變的氨基酸序列。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的腺苷脫氨酶，其中，在(iii)中，所述多聚體包含任意兩個如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列構成的二聚體，所述任意兩個如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列通過接頭連接。
18.根據權利要求17所述的腺苷脫氨酶，其中，所述接頭包含如seq?id?no:30所示的氨基酸序列。
19.根據權利要求1-18中任一項所述的腺苷脫氨酶用于在生物體或生物體細胞中進行基因編輯中的用途，或者在制備用于在生物體或生物體細胞中進行基因編輯的試劑中的用途。
20.一種融合蛋白，其包含：
21.根據權利要求20所述的融合蛋白，其中，所述核酸靶向結構域為tale、zfp或crispr效應蛋白結構域。
22.根據權利要求21所述的融合蛋白，其中，所述crispr效應蛋白選自cas3、cas4、cas5、cas5e(或casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1(或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf...
【專利技術屬性】
技術研發人員：高強，
申請(專利權)人：北京齊禾生科生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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