【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學領域，具體涉及新輔助化療后的乳腺癌類器官模型及構建方法與檢測應用。
技術介紹
1、
2、目前，乳腺癌的主要治療手段根據腫瘤的類型、分期和分子特征有不同的治療方案，主要包括外科手術、放射治療、化療、內分泌治療和靶向治療等。其中，新輔助化療是在癌癥手術或放療之前給予化療，其目的是縮小腫瘤體積，提高手術切除成功率，降低轉移風險，并初步觀察化療方案的有效性。
3、然而，乳腺癌腫瘤中存在明顯的異質性，新輔助化療后殘留的癌灶可能出現獲得性耐藥或多藥耐藥，使得腫瘤對化療藥物的敏感性降低，從而限制了化療藥物的選擇。對于新輔助化療效果不佳的患者，殘留的耐藥性腫瘤細胞不僅增加了局部復發的風險，還可能通過血液或淋巴系統轉移到身體其他部位，形成遠處轉移。轉移性乳腺癌的治療難度更大，預后較差。
4、目前，新輔助化療后的殘留腫瘤管理仍是一個挑戰。常規影像學檢查有時難以區分化療后的纖維化組織和殘留活性癌組織。如何為每個患者制定個體化的后續治療方案，包括化療、靶向治療和免疫治療的組合，是臨床治療中的一個重大挑戰。因此，臨床中急需新的檢測手段和依據，為后續治療方案的選擇提供指導性意見。
5、本專利技術旨在通過新輔助化療后的乳腺癌活性組織建立類器官培養模型，保留患者癌組織的異質性和微環境情況，用于后續的藥物敏感性檢測等應用，為新輔助化療后的個體化治療方案提供新的依據和參考。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是如何通過新輔助化療后的乳腺
2、為解決上述技術問題，本專利技術首先提供了一種乳腺癌類器官的構建方法，所述構建方法包括如下步驟：
3、a1）將乳腺癌組織在乳腺癌類器官培養液、膠原酶和rock抑制劑存在的條件下進行消化、分離，得到乳腺癌細胞；
4、a2）將所述乳腺癌細胞與基質膠混合，固化后加入乳腺癌類器官培養液進行培養，得到所述乳腺癌類器官；
5、所述乳腺癌類器官培養液是在基礎培養液addmem/f12+++的基礎上添加wnt3a重組蛋白、r-spondin1重組蛋白、noggin重組蛋白、b27補充劑、煙酰胺、n-乙酰半胱氨酸、primocin抗生素、氫化可的松、β-雌二醇、福斯可林、y-27632、heregulin?b1、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子10、a83-01、表皮生長因子、sb202190、胰島素樣生長因子1、肝細胞生長因子、白介素6、白介素8、維生素c、谷胱甘肽、sb431542和chir99021得到；
6、所述基礎培養液addmem/f12+++是在高級dmem/f12基礎培養液的基礎上添加青霉素-鏈霉素、谷氨酰胺增強劑和hepes緩沖液得到；
7、所述高級dmem/f12基礎培養液的組成包括葡萄糖、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、丙酮酸鈉、酚紅、乙醇胺、谷胱甘肽、抗壞血酸磷酸酯、重組全鏈胰島素、全鐵轉鐵蛋白、albumax??ii富脂牛血清白蛋白、硒酸鈉、偏釩酸銨、硫酸銅和氯化錳，余量為水（如無菌蒸餾水）。
8、上述構建方法中，所述乳腺癌類器官培養液的組成可為：100?ng/ml的wnt3a重組蛋白、500?ng/ml的r-spondin1重組蛋白、100?ng/ml的noggin重組蛋白、體積百分數為2%的（1x）b27補充劑、10?mm煙酰胺、1.25?mm?n-乙酰半胱氨酸、100?μg/ml?primocin抗生素、0.5μg/ml氫化可的松、100?nm?β-雌二醇、10?μm福斯可林、5?μm?y-27632、5?nm?heregulin?b1、5?ng/ml成纖維細胞生長因子7、20?ng/ml成纖維細胞生長因子10、0.5?μm?a83-01、5?ng/ml表皮生長因子、1?μm?sb202190、10?ng/ml胰島素樣生長因子1、20?ng/ml肝細胞生長因子、10?ng/ml白介素6、10?ng/ml白介素8、50?μm維生素c、5?mm谷胱甘肽、10?μm?sb431542和3?μm?chir99021，余量為基礎培養液addmem/f12+++；
9、所述基礎培養液addmem/f12+++的組成可為：體積百分數為1%的青霉素-鏈霉素、體積百分數為1%的谷氨酰胺增強劑和體積百分數為1%的hepes緩沖液，余量為高級dmem/f12基礎培養液；
10、所述高級dmem/f12基礎培養液的組成可為：3151?mg/l的葡萄糖、8.9?mg/l的l-丙氨酸、15?mg/l的l-天冬酰胺、13.3?mg/l的l-天冬氨酸、14.7?mg/l的l-谷氨酸、7.5?mg/l的甘氨酸、11.5?mg/l的l-脯氨酸、10.5?mg/l的l-絲氨酸、110?mg/l的丙酮酸鈉、8.1?mg/l的酚紅、1.9?mg/l的乙醇胺、1?mg/l的谷胱甘肽、2.5?mg/l的抗壞血酸磷酸酯、10?mg/l的重組全鏈胰島素、7.5?mg/l的全鐵轉鐵蛋白、400?mg/l的albumax??ii富脂牛血清白蛋白、5?μg/l的硒酸鈉、0.3?mg/l的偏釩酸銨、1.3?μg/l的硫酸銅和0.05?mg/l的氯化錳，余量為水（如無菌蒸餾水）。
11、上述方法中，所述乳腺癌組織可來源于新輔助化療后的乳腺癌患者。
12、上述方法中，所述膠原酶可為膠原酶ⅱ。
13、上述方法中，所述rock抑制劑選自y-27632、法舒地爾、利帕舒地爾、貝舒地爾、瑞舒地爾、ha-100、h-1152，及其鹽、堿、酯或前藥。
14、上述方法中，a2）中所述混合的比例可為5×104-1×105個所述乳腺癌細胞：100?μl的（100%濃度）基質膠。
15、進一步地，所述構建方法可為體外構建方法。
16、上述方法中，所述乳腺癌組織可來源于乳腺癌患者或新輔助化療后的乳腺癌患者的手術切除標本或活檢標本。
17、上述方法中，所述乳腺癌類器官可為新輔助化療后的乳腺癌類器官。
18、上述方法中，在所述a1）步驟之前還包括對乳腺癌組織的預處理步驟，所述預處理步驟可包括剪成組織碎塊和清洗。
19、進一步地，所述預處理步驟可包括如下：
20、（1）清除所述乳腺癌組織中的壞死組織、脂肪和血管；
21、（2）將所述乳腺癌組織剪成組織碎塊，使組織碎塊中單個小塊大小為0.5-1?mm3；
22、（3）將所述組織碎塊用d-bsa培養液清洗。
23、上述方法中，a1）中所述消化的條件可為在37℃條件下消化30-40分鐘本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種乳腺癌類器官的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述乳腺癌類器官培養液的組成為：100?ng/mL的Wnt3a重組蛋白、500?ng/mL的R-spondin1重組蛋白、100?ng/mL的Noggin重組蛋白、體積百分數為2%的（1X）B27補充劑、10?mM煙酰胺、1.25?mM?N-乙酰半胱氨酸、100?μg/ml?Primocin抗生素、0.5?μg/ml氫化可的松、100?nM?β-雌二醇、10?μM福斯可林、5?μM?Y-27632、5?nM?Heregulin?B1、5?ng/ml成纖維細胞生長因子7、20?ng/ml成纖維細胞生長因子10、0.5?μM?A83-01、5?ng/ml表皮生長因子、1?μM?SB202190、10?ng/mL胰島素樣生長因子1、20?ng/mL肝細胞生長因子、10?ng/mL白介素6、10?ng/mL白介素8、50?μM維生素C、5?mM谷胱甘肽、10?μM?SB431542和3?μM?CHIR99021，余量為基礎培養液adDMEM/F12+++；p>
3.根據權利要求1或2所述的構建方法，其特征在于，所述乳腺癌組織來源于新輔助化療后的乳腺癌患者。
4.根據權利要求1-3中任一所述的構建方法，其特征在于，所述膠原酶為膠原酶Ⅱ，所述ROCK抑制劑選自Y-27632、法舒地爾、利帕舒地爾、貝舒地爾、瑞舒地爾、HA-100、H-1152，及其鹽、堿、酯或前藥。
5.根據權利要求1-4中任一所述的構建方法，其特征在于，A2）中所述混合的比例為5×104-1×105個所述乳腺癌細胞：100?μl的基質膠。
6.通過權利要求1-5中任一所述的構建方法獲得的乳腺癌類器官。
7.權利要求6所述的乳腺癌類器官在下述任一項中的應用：
8.權利要求6所述的乳腺癌類器官的鑒定方法，其特征在于，所述方法包括利用定量PCR方法檢測腫瘤表型相關的基因表達，所述腫瘤表型相關的基因包括ESR1、PGR、HER2、MKI67、KRT5、KRT6A、KRT8和/或KRT18。
9.一種檢測新輔助化療后乳腺癌藥物敏感性的方法，其特征在于，所述方法包括使權利要求6所述的乳腺癌類器官與待測乳腺癌藥物接觸。
10.用于構建和/或培養新輔助化療后乳腺癌類器官的組合物，其特征在于，所述組合物包括Wnt3a重組蛋白、R-spondin1重組蛋白、Noggin重組蛋白、B27補充劑、煙酰胺、N-乙酰半胱氨酸、Primocin抗生素、氫化可的松、β-雌二醇、福斯可林、Y-27632、Heregulin?B1、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子10、A83-01、表皮生長因子、SB202190、胰島素樣生長因子1、肝細胞生長因子、白介素6、白介素8、維生素C、谷胱甘肽、SB431542、CHIR99021、青霉素-鏈霉素、谷氨酰胺增強劑、HEPES緩沖液、葡萄糖、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、丙酮酸鈉、酚紅、乙醇胺、谷胱甘肽、抗壞血酸磷酸酯、重組全鏈胰島素、全鐵轉鐵蛋白、AlbuMAX??II富脂牛血清白蛋白、硒酸鈉、偏釩酸銨、硫酸銅和氯化錳。
...【技術特征摘要】
1.一種乳腺癌類器官的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述乳腺癌類器官培養液的組成為：100?ng/ml的wnt3a重組蛋白、500?ng/ml的r-spondin1重組蛋白、100?ng/ml的noggin重組蛋白、體積百分數為2%的（1x）b27補充劑、10?mm煙酰胺、1.25?mm?n-乙酰半胱氨酸、100?μg/ml?primocin抗生素、0.5?μg/ml氫化可的松、100?nm?β-雌二醇、10?μm福斯可林、5?μm?y-27632、5?nm?heregulin?b1、5?ng/ml成纖維細胞生長因子7、20?ng/ml成纖維細胞生長因子10、0.5?μm?a83-01、5?ng/ml表皮生長因子、1?μm?sb202190、10?ng/ml胰島素樣生長因子1、20?ng/ml肝細胞生長因子、10?ng/ml白介素6、10?ng/ml白介素8、50?μm維生素c、5?mm谷胱甘肽、10?μm?sb431542和3?μm?chir99021，余量為基礎培養液addmem/f12+++；
3.根據權利要求1或2所述的構建方法，其特征在于，所述乳腺癌組織來源于新輔助化療后的乳腺癌患者。
4.根據權利要求1-3中任一所述的構建方法，其特征在于，所述膠原酶為膠原酶ⅱ，所述rock抑制劑選自y-27632、法舒地爾、利帕舒地爾、貝舒地爾、瑞舒地爾、ha-100、h-1152，及其鹽、堿、酯或前藥。
5.根據權利要求1-4中任一所述的構建方法，其特征在于，a2）中所述混合...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳俊東，鄧梓濠，陳澤曉，
申請(專利權)人：汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。