【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及酶工程領域，特別涉及酶突變體、酶組合物或其固定化酶及其制備蟲草素的應用和方法。
技術介紹
1、蟲草素又稱冬蟲夏草素、蟲草菌素、蛹蟲草菌素，別名3’-脫氧腺苷,化學式為c10h13n5o3，是第一種從真菌中分離出來的核苷類抗生素。其應用歷史悠久，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種藥理活性，三期臨床實驗數據也顯示蟲草素可用于治療急性前b和前t淋巴細胞白血病患者。近年來生物學研究進一步發現蟲草素可以增強人類免疫力和清楚因人老齡化引起的體內自由基增加的功效。
2、目前蟲草素主要是通過人工培育的蛹蟲草中提取分離獲得，制備成本高、價格昂貴、污染大且規模化受限。化學合成法則以腺苷為原料，通過多步驟的基團保護操作、自由基還原然后脫保護得到；整個合成步驟繁瑣、收率低、生產價格昂貴。
3、蟲草素是天然化合物，通過生物法制備具有環境兼容、產品品質高以及價格便宜的優勢。蟲草素的生物合成研究早有報道，原料腺苷在cns3激酶的作用下磷酸化得到3’-磷酸腺苷(3’-amp),然后在cns2酶的作用下脫磷酸得2’-糖基-3’-脫氧腺苷，最后在cns1酮還原酶作用下生成3’-脫氧腺苷(蟲草素)。然而，該合成通路的酶僅分布在少數真菌體內，并且對它們在工業菌進行異源表達時存在溶解性問題。
4、因此，提供一種生物法制備蟲草素具有重要的現實意義。
技術實現思路
1、有鑒于此，為解決以上問題，通過實驗室長時間測試研究，最終得到具有工業化性能的cns3、cns1替代
2、為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了酶的突變體，所述酶包括蟲草素激酶(cor3k)、蟲草素脫磷酸酶(cordep)、蟲草素還原酶(corred)、丙酮酸激酶(pcpyk)和/或甲酸脫氫酶(mspfdh)中的一種或多種；
4、所述蟲草素激酶(cor3k)的突變位點包括r13a、m14l、w32t、g35f、d63s、g64m、d65q、r68i、g70m、n72y、n73k、i89v、q157t或k180s中的一個或多個；
5、所述蟲草素脫磷酸酶(cordep)的突變位點包括k130n、e149d或a175v中的一個或多個；
6、所述蟲草素還原酶(corred)的突變位點包括s68m、e69g、e70f、r81v、k89s、p92w、f127n、g128i、t133v、r184a、h187t或n198d中的一個或多個；
7、所述丙酮酸激酶(pcpyk)的突變位點包括f31i、p99n、g105l、p169m、d248t或w312f中的一個或多個；
8、所述甲酸脫氫酶(mspfdh)的突變位點包括p12c、q35t或y188l中的一個或多個。
9、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述酶的突變體中，所述蟲草素激酶(cor3k)來源于多形擬桿菌(bacteroides?thetaiotaomicron,uniprot?id:q8aaq1,ec?2.7.1.25)；
10、所述蟲草素脫磷酸酶(cordep)來源于蛹蟲草(cordyceps?militaris,uniprotid:g3jf09)；
11、所述蟲草素還原酶(corred)來源于西伯利亞熱球菌(thermococcus?sibiricus,uniprot?id:c6a1z0)；
12、所述丙酮酸激酶(pcpyk)來源于泉古菌pyrobaculum?calidifontis(uniprot?id:a3ms52,ec?2.7.1.40)；
13、所述甲酸脫氫酶(mspfdh)來源于微桿菌屬microbacterium?sp。
14、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述酶的突變體包括蟲草素激酶(cor3k)的突變體、蟲草素脫磷酸酶(cordep)的突變體、蟲草素還原酶(corred)的突變體、丙酮酸激酶(pcpyk)的突變體和/或甲酸脫氫酶(mspfdh)的突變體；
15、其中，所述蟲草素激酶(cor3k)的突變體具有：
16、(i)、如seq?id?no.1所示的氨基酸序列；
17、(ii)、如(i)所述的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列，且與(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
18、(iii)、與如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性的氨基酸序列；或
19、所述蟲草素脫磷酸酶(cordep)的突變體具有：
20、(i)、如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；
21、(ii)、如(i)所述的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列，且與(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
22、(iii)、與如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性的氨基酸序列；或
23、所述蟲草素還原酶(corred)的突變體具有：
24、(i)、如seq?id?no.3所示的氨基酸序列；
25、(ii)、如(i)所述的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列，且與(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
26、(iii)、與如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性的氨基酸序列；或
27、所述丙酮酸激酶(pcpyk)的突變體具有：
28、(i)、如seq?id?no.4所示的氨基酸序列；
29、(ii)、如(i)所述的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列，且與(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
30、(iii)、與如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性的氨基酸序列；或
31、所述甲酸脫氫酶(mspfdh)的突變體具有：
32、(i)、如seq?id?no.5所示的氨基酸序列；
33、(ii)、如(i)所述的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列，且與(i)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
34、(iii)、與如(i)或(ii)所述的氨基酸序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性的氨基酸序列。
35、第二方面，本專利技術還提供了酶組合物或其固定化酶，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.酶的突變體，其特征在于，所述酶包括蟲草素激酶(Cor3K)、蟲草素脫磷酸酶(CorDep)、蟲草素還原酶(CorRed)、丙酮酸激酶(PcPyK)和/或甲酸脫氫酶(MspFDH)中的一種或多種；
2.如權利要求1所述的酶的突變體，其特征在于，所述蟲草素激酶(Cor3K)來源于多形擬桿菌(Bacteroides?thetaiotaomicron,Uniprot?ID:Q8AAQ1,EC?2.7.1.25)；
3.如權利要求1或2所述的酶的突變體，其特征在于，所述酶的突變體包括蟲草素激酶(Cor3K)的突變體、蟲草素脫磷酸酶(CorDep)的突變體、蟲草素還原酶(CorRed)的突變體、丙酮酸激酶(PcPyK)的突變體和/或甲酸脫氫酶(MspFDH)的突變體；
4.酶組合物或其固定化酶，其特征在于，包括如權利要求1至3任一項所述的酶的突變體。
5.編碼如權利要求1至3任一項所述的酶的突變體或如權利要求4所述酶組合物或其固定化酶的核酸分子。
6.如權利要求5所述的核酸分子，其特征在于，包括編碼所述蟲草素激酶(Cor3K)的
7.表達載體或宿主，其特征在于，所述表達載體包括如權利要求5或6所述的核酸分子；
8.如下任意項在制備蟲草素中的應用；
9.蟲草素的制備方法，其特征在于，以腺苷為原料，經如下任意項轉化制得蟲草素；
10.如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，以腺苷(Adenosine)作為起始原料，利用所述蟲草素激酶(Cor3K)的突變體作用下生成3’-磷酸腺苷(3’-AMP)，再利用所述蟲草素脫磷酸酶(CorDep)的突變體生成脫水腺苷，最后在所述蟲草素還原酶(CorRed)的突變體的轉化下生成蟲草素；
...【技術特征摘要】
1.酶的突變體，其特征在于，所述酶包括蟲草素激酶(cor3k)、蟲草素脫磷酸酶(cordep)、蟲草素還原酶(corred)、丙酮酸激酶(pcpyk)和/或甲酸脫氫酶(mspfdh)中的一種或多種；
2.如權利要求1所述的酶的突變體，其特征在于，所述蟲草素激酶(cor3k)來源于多形擬桿菌(bacteroides?thetaiotaomicron,uniprot?id:q8aaq1,ec?2.7.1.25)；
3.如權利要求1或2所述的酶的突變體，其特征在于，所述酶的突變體包括蟲草素激酶(cor3k)的突變體、蟲草素脫磷酸酶(cordep)的突變體、蟲草素還原酶(corred)的突變體、丙酮酸激酶(pcpyk)的突變體和/或甲酸脫氫酶(mspfdh)的突變體；
4.酶組合物或其固定化酶，其特征在于，包括如權利要求1至3任一項所述的酶的突變體。
5.編碼如權利要求1至3任一項所述的酶的突變體或如權利要求4所述酶組合物或其固定化酶的核酸...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃華，張新帥，劉寒，馮晨曦，沈鈳，張雨坤，
申請(專利權)人：華南師范大學，
類型：發明
國別省市：
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