采用惰性多孔載體的纖維素酶固態發酵方法技術

本發明專利技術公開了屬于工業發酵技術領域的一種采用惰性多孔載體的纖維素酶固態發酵方法。以固體培體養基為發酵基質，加入聚氨酯泡沫等惰性多孔載體可顯著提高纖維素酶的生產強度，吸附在惰性基質上的菌體可以用于半連續發酵，發酵殘基可全部用于產品的提??；以吸附在惰性載體上的液體培養基為發酵基質時，纖維素酶的半連續發酵更易于進行，同時該體系的抗剪切能力也顯著增強，從而使纖維素酶的固態發酵不僅僅局限在淺盤反應器內進行。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于工業發酵
，特別涉及一種采用惰性多孔載體的纖維素酶 固態發酵方法。
技術介紹
固態發酵是指在固態、半固態或富含營養物質的惰性載體上培養微生物的方 法。與液態發酵相比，固態發酵過程三廢排放少，環境污染較小，能耗較低， 設備投資小，產品的后處理過程一般比較簡單，許多產品可以直接烘干而無需提 取，產品易于忙藏、運輸，而且穩定性好。然而，由于傳統的固態發酵中傳質、 傳熱效率低等問題在工業化規模生產中一直未得到很好的解決，這在很大程度上 制約了固態發酵技術的發展。為改善固態發酵過程，本專利技術將多孔惰性載體應用于纖維素酶的固態發酵 中，由于惰性載體具有較大的比表面并且能在發酵過程保持其結構，不但有效地 改善了發酵基質中的傳質和傳熱，從而顯著提高了纖維素酶的生產強度，而且吸 附在惰性載體上的菌體還可用于半連續發酵。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種，其特 征在于，該方法以惰性多孔材料為載體，包括1)以固態培養基為發酵基質，在發酵基質中加入惰性多孔載體，固態基質 與惰性多孔載體的質量比為(10-120): 1，接入相對于發酵基質的種子液質量的5-30%的纖維素酶產生菌，并以發酵過程中吸附在惰性多孔載體上的菌體為菌種，通過添加滅菌后的新鮮發酵基質繼續發酵以實現半連續化生產，而發酵殘基全部用于發酵產品的提??；2)以液體培養基為發酵基質，將其吸附在惰性多孔載體上，接入相對于發 酵基質的種子液質量5-30%的纖維素酶產生菌，耦合發酵與浸提過程，并以浸提 后吸附在惰性多孔載體上的菌體為菌種，通過添加滅菌后的新鮮液體發酵基質繼續發酵以實現半連續化生產纖維素酶。所述惰性多孔載體材料為聚氨酯泡沫、聚氯乙烯泡沫或聚苯乙烯泡沫。所述纖維素酶產生菌為綠色木霉(7V/c力oc/e7vz7s)、青霉(尸e/7j'L 鵬)、曲 霉(^■per^iWM,黑曲霉)或根霉(朋h叩〃s)。本專利技術的有益效果為(1).以固態培養基為發酵基質時，惰性載體明顯改 善了發酵過程中的傳質和傳熱，使生產強度顯著提高。利用吸附在惰性載體上的 菌體進行半連續發酵，發酵殘基全部用于產品的提取，可使產品的損失比一般需要浸提的半連續過程少。(2).以液體培養基為發酵基質時，該體系的抗剪切能力大大增強，從而使纖維素酶的固態發酵不僅僅局限在淺盤反應器內進行。 具體實施例方式以固態培養基為發酵基質的發酵 實施例1按無菌操作將發酵基質接入30% (指相對于發酵基質的種子液質量百分比) 綠色木霉(TrichodermaSR3.2942)菌種，發酵基質組成為4%NaOH溶液40°C 下浸泡24小時的堿處理稻殼、麩皮和無機鹽水溶液(按質量百分比濃度包括1% (NH4) 2S04、 0.3%KH2PO4、 0.5。/。MgS04和0.5%CaCL2)，稻殼與麩皮的質量比 為3: 7，發酵基質與無機鹽水溶液的質量比為1:1;把已滅菌的惰性多孔載體 加入發酵基質中，混合均勻，惰性多孔載體與發酵基質的質量比例為1: 24; pH 自然，培養溫度3(TC。結果表明，加入惰性多孔載體的發酵體系每克底物所產纖 維素酶酶活(濾紙酶活)比不加惰性載體的發酵體系纖維素酶酶活提高了 70.6%;加入惰性多孔載體的發酵體系所產纖維素酶酶活(濾紙酶活)最高值出現在料層厚度為4.5cra時，而不加入惰性多孔載體的發酵體系所產纖維素酶酶活(濾紙酶 活)最高值出現在料層厚度為3.0cm時，加入惰性多孔載體的發酵體系每克底物 所產纖維素酶酶活(濾紙酶活)最高值比不加惰性載體的發酵體系纖維素酶酶活 最高值提高了20.4%，對于相同的反應器，把惰性載體所占的體積考慮在內，加 入惰性多孔載體的發酵體系每體積底物所產纖維素酶酶活(濾紙酶活)比不加惰 性載體的發酵體系纖維素酶酶活仍提高了 12.8%。4實施例2依實施例1的步驟，發酵培養96小時，此時發酵基質中纖維素酶活性接近最 高，于無菌環境下，把固定化細胞的惰性多孔載體從發酵基質中分離出來，加入 新鮮的己滅菌的培養基中繼續發酵，新鮮培養基與第一次發酵基質的質量比為1: 1。實驗結果表明，第二次、第三次發酵的最高濾紙酶活分別為第一次批式發酵最高濾紙酶活的86.6%和47.7%，比不加入惰性多孔載體的發酵體系所產濾紙酶 活分別提高了40.6%和4%;第二次、第三次發酵的最高CMCase酶活分別為第一 次批式發酵最高CMCase酶活的92.9%和113.9%。 實施例3按無菌操作將發酵基質接入30% (指相對于發酵基質的種子液質量百分比) 綠色木霉(Trichoderma SP.3.2942)菌種，發酵基質組成為微晶纖維素、麩皮 和無機鹽水溶液(按質量百分比濃度包括1% (NH4) 2S04、 0.3%KH2PO4、 0.5%MgSOjn0.5%CaCL2，)，微晶纖維素與麩皮的質量比為3: 7，發酵基質與無 機鹽水溶液的質量比為l: 1;把以滅菌的惰性多孔載體加入發酵基質中，混合均 勻，惰性多孔載體與發酵基質的比例為1: 24; PH自然，培養溫度3(A:;于發 酵培養96小時時，發酵基質中纖維素酶活性接近最高，于無菌環境下，把固定 化細胞的惰性多孔載體從發酵基質中分離出來，加入新鮮的已滅菌的培養基中繼 續發酵，新鮮培養基與第一次發酵基質的質量比為1: 1。實驗結果表明，第二次、 第三次發酵的最高濾紙酶活分別為第一次批式發酵最高濾紙酶活的85.2%和 60.8%;第二次、第三次發酵的最高CMCase酶活分別為第一次批式發酵最高 CMCase酶活的151.1%和86.0%。以液體固態培養基為發酵基質的發酵-實施例4:綠色木霉采用惰性多孔載體半連續發酵一浸提耦合法固態發酵生產 纖維素酶，具體步驟如下(1)在500ml燒瓶中加入2g聚氨酯泡沫惰性多孔載體，滅菌后接入30%(指 相對于聚氨酯泡沫的飽和吸附量百分比)綠色木霉(Trichoderma SP.3.2942)種子液。5(2) 配制營養液在100ml的10%麩皮汁(20g麩皮在200ml去離子水中煮 15分鐘過濾而得)中加入4g葡萄糖、2g硫酸氨、0.5g吐溫40、 O.lg硫酸鈉以及 lgCMC。將營養液加到己接種載體上，在載體達到飽和吸附量后繼續添加直至燒瓶中游離 的營養液達到100ml，然后將其放在轉速為130r/min的搖床上在30'C下進行發酵。(3) 當發酵進行到第三天的時候(酶活達到最大)將游離的營養液取出，用 0.01mol/L的醋酸緩沖液(PH4.8) 200ml分兩次浸提載體，浸提完后將載體放回 燒瓶中加入100ml的營養液后繼續發酵。(4) 然后每三天一個批次重復操作4，直至發酵結束。發酵過程中所產纖維素酶大部分隨營養液的更換而被取出，還有一部分通過 浸提載體獲得。該固態發酵方法可進行5個批次，將一次接種后的可生產周期從 6天延長到了 17天，與相同條件的批式發酵相比，采用該方法纖維素酶的濾紙酶 活的生產強度(平均每天獲得的濾紙酶活)提高了 54.5%。實施例5:黑曲霉采用惰性多孔載體半連續發酵一浸提耦合法固態發酵生產 纖維素酶，具體步驟與實施例1相同，只是將發酵菌種換成黑曲霉。在本實驗中，發 酵也進行了5個批次，與相同條件的批式發酵相比，濾紙酶活的生產強度提高了 57.4%。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種采用惰性多孔載體的纖維素酶固態發酵方法，其特征在于，該方法以惰性多孔材料為載體，包括：?。保┮怨虘B培養基為發酵基質，在發酵基質中加入惰性多孔載體，固態基質與惰性多孔載體的質量比為（１０－１２０）∶１，接入相對于發酵基質的種子液質量 的５－３０％的纖維素酶產生菌，并以發酵過程中吸附在惰性多孔載體上的菌體為菌種，通過添加滅菌后的新鮮發酵基質繼續發酵以實現半連續化生產，而發酵殘基全部用于發酵產品的提?。弧。玻┮砸后w培養基為發酵基質，將其吸附在惰性多孔載體上，接入相對于 發酵基質的種子液質量５－３０％的纖維素酶產生菌，耦合發酵與浸提過程，并以浸提后吸附在惰性多孔載體上的菌體為菌種，通過添加滅菌后的新鮮液體發酵基質繼續發酵以實現半連續化生產纖維素酶。

【技術特征摘要】
1.一種采用惰性多孔載體的纖維素酶固態發酵方法，其特征在于，該方法以惰性多孔材料為載體，包括1)以固態培養基為發酵基質，在發酵基質中加入惰性多孔載體，固態基質與惰性多孔載體的質量比為(10-120)∶1，接入相對于發酵基質的種子液質量的5-30％的纖維素酶產生菌，并以發酵過程中吸附在惰性多孔載體上的菌體為菌種，通過添加滅菌后的新鮮發酵基質繼續發酵以實現半連續化生產，而發酵殘基全部用于發酵產品的提??；2)以液體培養基為發酵基質，將其吸附在惰性多孔載體上，接入相對于發酵基質的種子液質量5-30％的纖維...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周玉杰，張建安，胡鐵剛，劉建國，程可可，劉宏娟，劉德華，戴玲妹，
申請(專利權)人：清華大學，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]