本申請涉及微生物基因工程技術領域，尤其是涉及一種高產巖藻糖的大腸桿菌及其構建方法和應用。本申請提供了一種高產巖藻糖的大腸桿菌，所述大腸桿菌敲除2’?巖藻糖基乳糖的轉運蛋白和過表達巖藻糖的轉運蛋白；所述2’?巖藻糖基乳糖的轉運蛋白包括SetA和/或MdfA；所述巖藻糖的轉運蛋白包括FucP和/或EmrD。本申請提供了一種高產巖藻糖的大腸桿菌，在大腸桿菌的基因組中整合了帶有強啟動子的外源FUC轉運蛋白FucP或替換為強啟動子的內源轉運蛋白EmrD，同時敲除了2’?FL轉運蛋白SetA和/或MdfA，能夠使2’?FL的殘留量下降，使FUC的產量提高，效果十分顯著，具有較高的應用價值。
1、巖藻糖(fucose，fuc)是一種廣泛存在的天然糖，亦稱6-脫氧-半乳糖，l巖藻糖是構成母乳低聚糖的五種單糖之一，是人體八種必須糖之一，廣泛存在于動物、植物、藻類中，發揮重要的生理功能。l-巖藻糖可調解腸道菌群，調解腸道健康；可與病毒、細菌、毒素結合，阻止其感染細胞，從而增強機體抵抗力。l-巖藻糖具皮膚保濕功能，延緩皮膚衰老，刺激纖維母細胞增生，防止輻射、紫外線等對纖維母細胞造成的傷害。目前，fuc的商業化生產主要包括海藻酸水解提取巖藻多糖再純化、化學方法已己糖為原料轉化和酶水解產巖藻糖的細菌的胞外多糖等方法，這些l-巖藻糖生產方法存在經濟效益低，對環境不友好，應用場景有限等問題，因而專利技術新的l-巖藻糖生產方法具有潛在的應用價值。生物合成法僅需以廉價的碳源和細胞內可再生供體為原料，且以較低的環境代價獲得高經濟產出，因此具有更為廣闊的應用前景。
2、在微生物內fuc的合成前體包括胞內自身合成的gdp-l-巖藻糖、2’-巖藻糖基乳糖(2’-fl)以及外源添加乳糖作為媒介。其合成過程是，首先，果糖-6-磷酸在基因mana、manb、manc、gmd和wcag作用下合成gdp-l-巖藻糖，胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶lacy轉運至胞內，然后和gdp-l-巖藻糖作用合成2’-fl。2’-fl在α-l-巖藻糖苷酶的作用下分解為巖藻糖和乳糖。但目前fuc的微生物合成產量仍然較低，無法滿足大批量工業生產的需求。
>技術實現思路1、本申請的目的在于克服上述現有技術的不足之處而提供一種降低2’-fl轉運效率以提高fuc水平的大腸桿菌及其構建方法和應用。
2、為實現上述目的，本申請采取的技術方案為：
3、第一方面，本申請提供了一種高產巖藻糖的大腸桿菌，所述大腸桿菌中2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白表達水平或結合效率降低以及巖藻糖的轉運蛋白表達水平提高。
4、作為本申請所述大腸桿菌的優選實施方式，所述大腸桿菌敲除或敲減2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白以及過表達巖藻糖的轉運蛋白。
5、作為本申請所述大腸桿菌的優選實施方式，所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白包括seta和/或mdfa；所述巖藻糖的轉運蛋白包括fucp和/或emrd。
6、根據專利技術人前期研究發現，2’-fl在合成后較快的排出胞外，無法被α-l-巖藻糖苷酶催化水解為巖藻糖，同時巖藻糖生產后短時間內積累在胞內給細胞帶來生存壓力，這極大的限制fuc的積累。在此基礎上，本申請提供了一種高產巖藻糖的大腸桿菌，在大腸桿菌的基因組中整合了帶有強啟動子的外源fuc轉運蛋白fucp或替換為強啟動子的內源轉運蛋白emrd，同時敲除了2’-fl轉運蛋白seta和/或mdfa，能夠使2’-fl的殘留量下降，使fuc的產量提高，效果十分顯著，具有較高的應用價值。
7、作為本申請所述大腸桿菌的優選實施方式，所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白seta的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白mdfa的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
8、作為本申請所述大腸桿菌的優選實施方式，所述巖藻糖的轉運蛋白fucp為來源于大腸桿菌k-12的外源轉運蛋白，所述轉運蛋白fucp的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
9、作為本申請所述大腸桿菌的優選實施方式，所述巖藻糖的轉運蛋白emrd為內源轉運蛋白，所述轉運蛋白emrd的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
10、作為本申請所述大腸桿菌的優選實施方式，所述大腸桿菌以大腸桿菌fuc001為底盤菌株通過將2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白敲除或敲減，將整合后的外源巖藻糖的轉運蛋白或內源巖藻糖的轉運蛋白的天然啟動子替換為強啟動子制備得到。
11、作為本申請所述大腸桿菌的優選實施方式，所述強啟動子為t7啟動子、camv啟動子、sv40啟動子和sffv啟動子中的至少一種。
12、第二方面，本申請提供了上述大腸桿菌的構建方法，包括以下步驟：
13、s1、利用基因編輯技術將大腸桿菌fuc001中的2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白敲除或敲減，得到大腸桿菌a；所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白包括seta和/或mdfa；
14、s2、將步驟s1所得大腸桿菌a中巖藻糖的轉運蛋白編碼基因的天然啟動子替換為強啟動子，得到高產巖藻糖的大腸桿菌；所述巖藻糖的轉運蛋白包括fucp和/或emrd。
15、本申請利用基因編輯技術將2’-fl的轉運蛋白敲除以降低2’-fl的殘留量，從而提高fuc的積累。本申請通過基因編輯技術將轉運蛋白編碼基因的天然啟動子替換為強啟動子能夠提高內源轉運蛋白的表達水平，從而提高lnnt轉運至胞外以提高fuc的胞外濃度。
16、作為本申請所述構建方法的優選實施方式，當所述巖藻糖的轉運蛋白為fucp時，所述步驟s2的操作如下：構建帶有強啟動子編碼序列和fucp蛋白編碼序列的表達盒，將表達盒片段克隆至表達載體中并轉化至步驟s1所得大腸桿菌a中，得到高產巖藻糖的大腸桿菌。
17、作為本申請所述構建方法的優選實施方式，所述大腸桿菌fuc001主要由以下步驟制備得到：
18、a1、通過基因編輯技術敲除大腸桿菌bl21star(de3)的β-半乳糖苷酶基因lacz、巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶基因簇fucik、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶基因wcaj，得到大腸桿菌ⅰ；
19、a2、將帶有磷酸甘露糖突變酶manb、甘露糖-1-磷酸鳥苷轉移酶manc、gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶gmd和gdp-l-巖藻糖合成酶wcag編碼序列的質粒轉入步驟a1所得大腸桿菌ⅰ中，得到大腸桿菌ⅱ；
20、a3、將帶有α-1,2-巖藻糖基轉移酶wbgl和α-l-巖藻糖苷酶afca編碼序列的質粒轉入步驟a2所得大腸桿菌ⅱ中，得到大腸桿菌fuc001。
21、第三方面，本申請提供了上述大腸桿菌在生產巖藻糖中的應用。
22、第四方面，本申請提供了一種巖藻糖的生產方法，主要由上述大腸桿菌通過補料分批發酵得到。
23、與現有技術相比，本申請具有以下有益效果：
24、本申請提供了一種高產巖藻糖的大腸桿菌，在大腸桿菌的基因組中整合了帶有強啟動子的外源fuc轉運蛋白fucp或替換為強啟動子的內源轉運蛋白emrd，同時敲除了2’-fl轉運蛋白seta和/或mdfa，能夠使2’-fl的殘留量從10-12g/l下降到2g/l以內，使fuc的產量從50.1g/l提高到66.5g/l，效果十分顯著，具有較高的應用價值。
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【技術保護點】
1.一種高產巖藻糖的大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌中2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白表達水平或結合效率降低以及巖藻糖的轉運蛋白表達水平提高。
2.如權利要求1所述的大腸桿菌，其特征在于，所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白包括SetA和/或MdfA；所述巖藻糖的轉運蛋白包括FucP和/或EmrD。
3.如權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于，所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白SetA的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白MdfA的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
4.如權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于，所述巖藻糖的轉運蛋白FucP為來源于大腸桿菌K-12的外源轉運蛋白，所述轉運蛋白FucP的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
5.如權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于，所述巖藻糖的轉運蛋白EmrD為內源轉運蛋白，所述轉運蛋白EmrD的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
6.如權利要求1所述的大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌以大腸桿菌FUC001為底盤菌株通過將2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白敲除或敲減，將整合后的外源巖藻糖轉運蛋白或內源巖藻糖的轉運蛋白的天然啟動子替換為強啟動子制備得到。
7.如權利要求1-6任一項所述大腸桿菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.如權利要求7所述的構建方法，其特征在于，當所述巖藻糖的轉運蛋白為FucP時，所述步驟S2的操作如下：構建帶有強啟動子編碼序列和FucP蛋白編碼序列的表達盒，將表達盒片段克隆至表達載體中并轉化至步驟S1所得大腸桿菌A中，得到高產巖藻糖的大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的構建方法，其特征在于，所述大腸桿菌FUC001主要由以下步驟制備得到：
10.如權利要求1-6任一項所述的大腸桿菌在生產巖藻糖中的應用。
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【技術特征摘要】
1.一種高產巖藻糖的大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌中2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白表達水平或結合效率降低以及巖藻糖的轉運蛋白表達水平提高。
2.如權利要求1所述的大腸桿菌，其特征在于，所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白包括seta和/或mdfa；所述巖藻糖的轉運蛋白包括fucp和/或emrd。
3.如權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于，所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白seta的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述2’-巖藻糖基乳糖的轉運蛋白mdfa的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
4.如權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于，所述巖藻糖的轉運蛋白fucp為來源于大腸桿菌k-12的外源轉運蛋白，所述轉運蛋白fucp的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
5.如權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于，所述巖藻糖的轉運蛋白emrd為內源轉運蛋白，所述轉運...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳金勇，夏子涵，陳祥松，袁麗霞，姚建銘，
申請(專利權)人：合肥中科健康生物產業技術研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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