【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種鴨胚原代肝臟細胞完全培養基、鴨胚原代肝臟細胞的培養方法。
技術介紹
1、肝臟是鴨的重要內臟器官，鴨肝細胞是鴨肝臟的主要功能細胞。隨著人們生活水平和飲食結構的不斷改變，對鴨的市場需求不斷擴大，所以關于鴨的研究也越來越深入。但是，由于鴨肝臟細胞沒有成熟的細胞系，現行的原代肝臟細胞分離方法大多不完善且對技術要求較高，嚴重制約了鴨的研究發展。
2、以往大多數研究，選用雞或哺乳動物肝臟細胞系替代鴨肝臟細胞進行試驗。但是，鴨與雞或哺乳動物肝臟具有較大差別，所獲得的試驗結果并不具備代表性，因而，分離培養鴨原代肝臟細胞為探究鴨肝臟功能及機制提供了良好的基礎。
3、目前，原代細胞分離培養主要分為機械法和膠原酶灌注法。由于機械法對細胞造成的損傷較大，所以膠原酶灌注法一直是分離肝臟細胞的經典方法，至今仍被廣泛應用。膠原酶灌注法分離的細胞純度高，活力好，但是實施難度大，灌流過程需要恒流泵等特殊裝置，對操作人員技術要求高，且難以在一般實驗室應用。雖然，科研人員對分離方法進行不斷改進，但是分離的肝細胞仍存在很多問題，比如成纖維細胞污染，細胞活力低，難以傳代培養等。此外，鴨胚原代肝臟細胞分離必須用到鴨胚，且胚齡在14天左右，孵化過程繁瑣，耗時長，成本高。
4、針對肝臟細胞的傳代培養，研究較多的是魚肝臟細胞的傳代培養，具體可見cn104818239a一種暗色唇魚肝臟細胞系的構建方法，其培養基為：含有占總體積的20％的胎牛血清、濃度為50-150μg/ml的硫酸卡那霉素以及濃度為30-60μg/
5、但是，體內細胞生長的天然微環境十分復雜，除血管壁細胞和血液相關細胞，體內其它細胞都處于沒有血清的細胞外液中，成分復雜的細胞外液、細胞與細胞的相互作用、細胞與胞外基質的相互作用構成了體內細胞生長的復雜天然微環境。不同組織/器官來源的細胞在體內所處的微環境不同，如細胞外液成分種類、含量不同，細胞與細胞、細胞與胞外基質間相互作用不同，目前對體內復雜且多樣的微環境具體成分和相互作用機制知之甚少，只是探索了它的冰山一角，無法從中得到很好的啟發在體外模擬體內微環境進行細胞培養。因此如何在體外更好地模擬體內細胞生長環境是目前體外細胞培養尚未解決的一大難題。
6、本方案需要解決的問題：如何開發一種能夠特異性適用于鴨胚原代肝臟細胞的傳代培養的培養基。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種鴨胚原代肝臟細胞完全培養基，本專利技術在dmem基礎培養基中加入l-谷氨酰胺、轉鐵蛋白、牛胰島素、胎牛血清等物質，可以保持細胞狀態和活力，本專利技術的培養基不含生長因子，成本低廉，可讓肝臟細胞順利傳代到5代以上。
2、同時，本專利技術還公開了鴨胚原代肝臟細胞的培養方法。
3、為實現上述目的，本申請公開了一種鴨胚原代肝臟細胞完全培養基，包括：0.08～0.12wt％5×10-5m的地塞米松、0.8～1.2wt％200mm的l-谷氨酰胺、0.8～1.2wt％1mg/ml的轉鐵蛋白、0.08～0.12wt％10mg/ml的維生素c、0.08～0.12wt％10-4m的牛胰島素、0.8～1.2wt％雙抗、8～12wt％胎牛血清和余量的dmem基礎培養基。
4、在上述的鴨胚原代肝臟細胞完全培養基中，包括：0.1wt％5×10-5m的地塞米松、1wt％200mm的l-谷氨酰胺、1wt％1mg/ml的轉鐵蛋白、0.1wt％10mg/ml的維生素c、0.1wt％10-4m的牛胰島素、1wt％雙抗、10wt％胎牛血清和余量的dmem基礎培養基。
5、同時，本專利技術還公開了一種鴨胚原代肝臟細胞的培養方法，采用如上所述的完全培養基培養傳代培養鴨胚原代肝臟。
6、在上述的培養方法中，將鴨胚原代肝臟細胞消化后重懸于完全培養基中，然后過濾得到細胞，將細胞接種于含完全培養基的培養瓶中，置于37℃co2培養箱中培養；當觀察到培養瓶中的部分細胞或細胞團貼壁時，將細胞稀釋至設定濃度后接種到含完全培養基的細胞培養瓶或細胞培養板上，置于37℃co2培養箱中培養。
7、在上述的培養方法中，當細胞生長至80～90％時，去除完全培養基并清洗細胞，然后先后通過ⅳ型膠原酶、胰酶進行消化，消化結束后加入完全培養基進行重懸，然后將細胞稀釋至設定濃度后接種到含完全培養基的細胞培養瓶或細胞培養板上，置于37℃co2培養箱中培養。
8、在上述的培養方法中，所述鴨胚原代肝臟細胞的制備方法為：
9、(1)取孵化14天鴨蛋，對鴨蛋外殼進行消毒；
10、(2)消毒后將鴨蛋的外殼敲碎，打開卵殼膜，取出鴨胚；
11、(3)將鴨胚的鴨胚肝臟取出并浸泡于d-hank’s緩沖液中；
12、(4)去除鴨胚肝臟周圍黏連的疏松結締組織和肝被膜，將得到的肝組織在d-hank’s緩沖液中浸洗多次；
13、(5)將肝組織剪成塊，用d-hank’s緩沖液洗滌多次，將組織塊轉移至ⅳ型膠原酶中消化，直到消化為無肉眼可見組織塊的細胞懸液為止；
14、(6)向消化好的細胞懸液中加入胰酶消化，然后加入胎牛血清終止消化。
15、本申請的有益效果是：
16、本專利技術在dmem基礎培養基中加入l-谷氨酰胺、轉鐵蛋白、牛胰島素、胎牛血清等物質，可以保持細胞狀態和活力，本專利技術的培養基不含生長因子，成本低廉，可讓肝臟細胞順利傳代到5代以上。
17、本專利技術的鴨胚原代肝臟細胞消化分離培養方法能夠有效分離原代肝臟細胞，ⅳ型膠原酶和胰酶的聯合作用使細胞能夠得到充分的酶解，從而提高分離原代肝臟細胞的得率。在分離得到原代肝臟細胞后，往往很難傳代培養，本專利技術提供的ⅳ型膠原酶和胰酶的聯合消化法，很好地解決了傳代難、活力低等問題，使得分離得到的肝原代細胞具有較高的存活率和良好生長活力。
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1.一種鴨胚原代肝臟細胞完全培養基，其特征在于，包括：0.08～0.12wt％5×10-5M的地塞米松、0.8～1.2wt％200mM的L-谷氨酰胺、0.8～1.2wt％1mg/mL的轉鐵蛋白、0.08～0.12wt％10mg/mL的維生素C、0.08～0.12wt％10-4M的牛胰島素、0.8～1.2wt％雙抗、8～12wt％胎牛血清和余量的DMEM基礎培養基。
2.根據權利要求1所述的鴨胚原代肝臟細胞完全培養基，其特征在于，包括：0.1wt％5×10-5M的地塞米松、1wt％200mM的L-谷氨酰胺、1wt％1mg/mL的轉鐵蛋白、0.1wt％10mg/mL的維生素C、0.1wt％10-4M的牛胰島素、1wt％雙抗、10wt％胎牛血清和余量的DMEM基礎培養基。
3.一種鴨胚原代肝臟細胞的培養方法，其特征在于，采用如權利要求1或2所述的完全培養基培養傳代培養鴨胚原代肝臟。
4.根據權利要求3所述的培養方法，其特征在于，將鴨胚原代肝臟細胞消化后重懸于完全培養基中，然后過濾得到細胞，將細胞接種于含完全培養基的培養瓶中，置于37℃CO2培養箱中培
5.根據權利要求4所述的培養方法，其特征在于，當細胞生長至80～90％時，去除完全培養基并清洗細胞，然后先后通過Ⅳ型膠原酶、胰酶進行消化，消化結束后加入完全培養基進行重懸，然后將細胞稀釋至設定濃度后接種到含完全培養基的細胞培養瓶或細胞培養板上，置于37℃CO2培養箱中培養。
6.根據權利要求4所述的培養方法，其特征在于，所述鴨胚原代肝臟細胞的制備方法為：
...【技術特征摘要】
1.一種鴨胚原代肝臟細胞完全培養基，其特征在于，包括：0.08～0.12wt％5×10-5m的地塞米松、0.8～1.2wt％200mm的l-谷氨酰胺、0.8～1.2wt％1mg/ml的轉鐵蛋白、0.08～0.12wt％10mg/ml的維生素c、0.08～0.12wt％10-4m的牛胰島素、0.8～1.2wt％雙抗、8～12wt％胎牛血清和余量的dmem基礎培養基。
2.根據權利要求1所述的鴨胚原代肝臟細胞完全培養基，其特征在于，包括：0.1wt％5×10-5m的地塞米松、1wt％200mm的l-谷氨酰胺、1wt％1mg/ml的轉鐵蛋白、0.1wt％10mg/ml的維生素c、0.1wt％10-4m的牛胰島素、1wt％雙抗、10wt％胎牛血清和余量的dmem基礎培養基。
3.一種鴨胚原代肝臟細胞的培養方法，其特征在于，采用如權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王文策，李金澤，陳嘉慶，陳玟靜，鄧秋怡，李雪，王麗華，朱勇文，楊琳，曹慶云，葉慧，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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