【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物代謝工程領域，具體涉及一種高產o-琥珀酰-l-高絲氨酸的基因工程菌及其構建方法，以及該基因工程菌在微生物發酵制備o-琥珀酰-l-高絲氨酸中應用。
技術介紹
1、隨著氨基酸產業的發展和應用領域的不斷擴展，氨基酸市場也逐漸壯大。據統計，全球氨基酸市場規模已經超過200億美元，預計未來幾年將繼續保持高速增長。中國是全球氨基酸生產和消費的主要國家之一，氨基酸產業也成為了中國的戰略性新興產業之一。o-琥珀酰-l-高絲氨酸(osh)是一種重要的c4平臺化合物，以它為底物可以生產其他的高價值化學品，所以構建高效生產osh的細胞工廠有著廣闊的工業應用前景。
2、酰基高絲氨酸最早于1964年被rowbury發現，是微生物合成l-蛋氨酸的前體物質。在微生物體內，底物高絲氨酸經催化發生酰基化得到產物酰基高絲氨酸，后經特異性途徑合成蛋氨酸。酰基化過程的關鍵酶為高絲氨酸o-酰基轉移酶，該酶有較強的底物特異性，根據不同的酰基供體，可以分為高絲氨酸琥珀酰基轉移酶和高絲氨酸乙酰基轉移酶。在多數真菌和少數的細菌中，會使用高絲氨酸乙酰基轉移酶進行催化，如谷氨酸棒桿菌；大多數的細菌如大腸桿菌則會使用高絲氨酸琥珀酰基轉移酶進行催化。這兩者沒有序列相似性，但催化相似的酰基化反應時都遵循乒乓反應的酶化學機理。當琥珀酰輔酶a(succinylcoenzymea)作為酰基供體時，會將琥珀酰基轉移到親核殘基上，隨后轉移到高絲氨酸從而形成o-琥珀酰-l-高絲氨酸。
3、由于osh的合成途徑受到嚴格的調控，傳統誘變取得的成績并不理想，隨著
4、因此，需要一種新的方法來進行更有效的代謝工程優化，以促進osh的合成和最大限度地提高底物轉化率。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中大腸桿菌代謝合成osh產量不高的問題，本專利技術提供了一種具有良好生物合成能力的高產osh的基因工程菌及其構建方法與應用。為了獲得具有令人滿意的osh生物合成能力的大腸桿菌，本專利技術首先通過引入可解除“葡萄糖阻遏”的crp突變體(這類crp突變體在以葡萄糖為碳源的發酵過程中激活糖酵解和tca循環)，從而促進葡萄糖的利用和生物合成，受這種有益的crp突變體調控的大腸桿菌可作為氨基酸類生物合成的有利底盤；其次引入外源的甘油醛-3-磷酸脫氫酶及其突變體為代謝途徑提供更多nadph供應，實現胞內還原力的平衡，減輕高絲氨酸合成過程中消耗nadph對細胞生長造成的壓力，進一步提升osh的產量；最終獲得一株適合工業化生產的osh生產菌株，對擴大大腸桿菌的工業應用具有重要意義。
2、本專利技術采用的技術方案是：
3、一種高產o-琥珀酰-l-高絲氨酸的基因工程菌的構建方法，所述方法包括：利用crispr-cas9技術，在底盤菌基因組上引入解除葡萄糖阻遏的crp突變體的編碼基因。
4、進一步地，所述方法還包括：利用crispr-cas9技術，在底盤菌基因組上引入異源gapdh突變體的編碼基因；所述gapdh突變體用于增加nadph的供應。
5、本專利技術按照以下思路構建了所述的高產o-琥珀酰-l-高絲氨酸的基因工程菌：
6、(1)首先，camp受體蛋白(crp)是已知的主要介導碳源分解代謝的全局性調節因子。作為一種通過camp水平感知細胞能量狀態的全局調控主蛋白，crp可調控400多個基因，其中許多基因是分解葡萄糖以外的各種碳源所必需的。crp-camp復合物可激活編碼中央代謝途徑(如三羧酸(tca)循環、糖酵解)中的酶、轉運體和啟動碳代謝的酶的多個操作子。crp的蛋白結構已經得到了較為全面的研究，它包含一個與camp結合的n端結構域和一個與dna結合的c端結構域。據報道，它可以有效地提高菌株對各種脅迫的耐受性，如酒精、酸、溫度、有機溶劑和氧化應激。為了獲得具有良好生物合成能力的大腸桿菌細胞，本專利技術選擇引入解除“葡萄糖阻遏”的crp突變體。這類crp突變體有望在以葡萄糖為碳源的發酵過程中激活糖酵解和tca循環，從而促進葡萄糖的利用和生物合成。同時，含有crp突變體的細胞生長不良的菌株將在整個迭代篩選過程中被淘汰。受這種有益的crp突變體調控的大腸桿菌細胞可作為天然產物生物合成的有利底盤。因此，本專利技術利用crispr-cas9技術在基因組水平分別引入crp突變體crpe73g/r83l/g142h、crpr83f/g142p，實現高效底盤菌的構建。
7、(2)其次，在生物化學品生產中，輔因子回收被認為是至關重要的過程。nadph輔因子在氨基酸的生物合成和其他有價值的化學物質的合成中被用作還原力。為了解決普遍存在的輔因子失衡問題，需要提供充足的nadph輔因子。因此，通過提高nadph/nadp+的比值來提高大腸桿菌生產目標化學物質的效率是至關重要的。大腸桿菌作為osh生產菌株產生nadph主要有兩條途徑：磷酸戊糖途徑和檸檬酸循環。然而，以上兩條途徑在菌體內產nadph的能力有限，若想獲得更多的nadph供應則需通過引入外源高效的nadph合成酶。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)是中心碳代謝途徑中的關鍵酶，能催化nadp+和甘油醛-3-磷酸(g3p)生成nadph和3-磷酸-d-甘油酰磷酸，是nadph供應和解決輔因子失衡問題的主要靶點。本專利技術利用分子改造技術將來源于乙酰丁酸梭桿菌(clostridium?acetobutylicum)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶進行突變獲得有益突變體(gapdhr233a、gapdhf100v、gapdhf100v/p192s)，并將該突變體在前期構建的大腸桿菌osh生產菌中進行異源表達，增加osh合成過程中nadph的供應，從而提升發酵生產osh的能力。
8、本專利技術改造涉及到的基因及其相應的途徑見表1。
9、表1.菌株改造涉及到的基因及其相應的途徑
10、
11、作為優選，所述crp突變體選自crpe73g/r83l/g142h、crpr83f/g142p中的任意一種。
12、作為優選，所述gapdh突變體選自clostridium?acetob本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高產O-琥珀酰-L-高絲氨酸的基因工程菌的構建方法，其特征在于，
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRP突變體選自CRPE73G/R83L/G142H、CRPR83F/G142P中的任意一種。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述GAPDH突變體選自Clostridiumacetobutylicum來源的GAPDHcaR233A、Corynebacterium?glutamicum來源的GAPDHcgF100V、Corynebacterium?glutamicum來源的GAPDHcgF100V/P192S中的任意一種。
5.如權利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述底盤菌為E.coli?W3110ΔmetIΔmetJΔthrBΔmetBΔldhAΔadhEΔpflBPtrc-metLΔarcAΔiclR/pTrc99a-metA-yjeH。
6.如權利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，
7.如權利要求3或4所述的方法，其特征在于，
8.如權利要求1～4任一所述的方法構建得到的高產O-琥珀酰-L-高絲氨酸的基因工程菌。
9.如權利要求8所述的高產O-琥珀酰-L-高絲氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述高產O-琥珀酰-L-高絲氨酸的基因工程菌為：
10.如權利要求8所述的高產O-琥珀酰-L-高絲氨酸的基因工程菌在生產O-琥珀酰-L-高絲氨酸中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種高產o-琥珀酰-l-高絲氨酸的基因工程菌的構建方法，其特征在于，
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述crp突變體選自crpe73g/r83l/g142h、crpr83f/g142p中的任意一種。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述gapdh突變體選自clostridiumacetobutylicum來源的gapdhcar233a、corynebacterium?glutamicum來源的gapdhcgf100v、corynebacterium?glutamicum來源的gapdhcgf100v/p192s中的任意一種。
5.如權利要求1～4任一所述的方...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳志強，張曉健，劉鵬，李波，丁文清，王雙慧，吳琦，陳靜祥，鄭裕國，
申請(專利權)人：杭州優澤生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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