【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于食品微生物檢測，具體涉及一種定量檢測沙門氏菌的試紙。
技術(shù)介紹
1、沙門氏菌是一種在自然界廣泛存在的食源性致病菌，經(jīng)常寄居在人和動物的腸道中，可通過食物和糞便傳播，致病率極高。感染后可以引發(fā)多種疾病，如嘔吐腹瀉、發(fā)熱畏寒、腹絞痛等，嚴重者甚至會引發(fā)脫水導致死亡。因此，需要對食品中的沙門氏菌進行檢測來減少其傳播，確保食品安全問題。
2、生物培養(yǎng)法是檢測沙門氏菌的標準方法，包括預富集、選擇性富集和生化鑒定等步驟。這種方法雖然較為完善，但其檢測過程復雜漫長，需要4-7天才能得到明確結(jié)果，靈敏性差。免疫學方法利用抗原-抗體的特異性結(jié)合檢測沙門氏菌。這種方法的靈敏度有較大的提高，但其檢測需要較多的儀器和設(shè)備，且檢測成本高。基于核酸檢測的分子生物學方法，包括聚合酶鏈氏反應(yīng)法、滾環(huán)擴增法、環(huán)介導等溫擴增法等，雖然這些方法的檢測過程得到簡化，但需要專門的儀器設(shè)備，對操作人員的要求較高。重組酶聚合酶擴增(recom?binasepolymerase?amplification,?rpa)是一種新型的核酸檢測技術(shù)，檢測不需要額外的大型儀器，在20?min內(nèi)可以實現(xiàn)特定核酸序列的指數(shù)級擴增，是一種操作簡單、反應(yīng)高效、靈敏度高、特異性強的檢測技術(shù)。然而，目前沒有專門的軟件或網(wǎng)站用于rpa引物的設(shè)計，只能通過設(shè)計多個候選引物進行篩選。并且rpa需要嚴格的擴增條件來避免假陽性結(jié)果，需要實驗者摸索和實驗驗證確定適合rpa的引物和條件。
3、側(cè)流免疫分析法(lateral?flow?assay,?lfa)是以紙基作為平臺，
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本專利技術(shù)提供一種雙信號探針檢測腸炎沙門氏菌的側(cè)流層析試劑盒，包括用于rpa的上、下游引物，比色和sers雙信號探針，rpa產(chǎn)物通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)與雙信號探針連接并被捕獲在檢測區(qū)域。在整個檢測過程中不需要大型實驗設(shè)備，檢測結(jié)果雙信號讀出，靈敏度高、特異性好。
2、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案。
3、一種拉曼標簽鏈霉親和素（aunp@pda@agmba-sa），由內(nèi)到外依次為金納米顆粒（aunp）內(nèi)核，包裹aunp的聚多巴胺（pda）外殼，包裹外殼的鏈霉親和素（sa）粘附層；所述pda外殼附著連接4-羧基苯硫酚基的ag顆粒；所述粘附層包含聚乙二醇2000（peg-2000）、胎牛血清（bsa）和sa；所述aunp為球形，粒徑為20nm-30nm；所述pda外殼厚度為3nm-5nm；所述pda上ag顆粒的粒徑為3nm-5nm。
4、上述拉曼標簽鏈霉親和素可用于制備側(cè)向?qū)游鲈嚰垼瑐?cè)向?qū)游鲈嚰埖臋z測物上結(jié)合生物素。
5、一種拉曼標簽鏈霉親和素的制備方法，包括以下步驟：
6、（1）氯金酸以檸檬酸還原，獲得金納米顆粒（aunps）；
7、（2）aunps在過氧化氫中與多巴胺鹽酸鹽（da·hcl）反應(yīng)，獲得aunp@pda；
8、（3）aunp@pda與聚乙烯吡咯烷酮（pvp-10）和銀氨溶液反應(yīng)，獲得aunp@pda@ag；
9、（4）aunp@pda@ag與4-巰基苯甲酸（4-mba）反應(yīng)，在獲得aunp@pda@agmba；
10、（5）通過聚乙二醇2000（peg-2000）和胎牛血清蛋白（bsa）將鏈霉親和素（sa）附著在aunp@pda@agmba上，獲得拉曼標簽鏈霉親和素（aunp@pda@agmba-sa）。
11、具體地，上述制備方法，包括以下步驟：
12、（a）氯金酸溶液和過量三水合檸檬酸鈉溶液在沸騰狀態(tài)下反應(yīng)，獲得球形金納米顆粒（aunps）懸液；
13、（b）將球形金納米顆粒懸液的ph調(diào)為中性，然后加入h2o2和鹽酸多巴胺反應(yīng)，在球形金納米顆粒外包裹聚多巴胺層，獲得球形aunp@pda的懸液；
14、（c）aunp@pda的懸液中加入pvp-10和銀氨溶液室溫反應(yīng)，在聚多巴胺上生成ag顆粒，獲得aunp@pda@ag懸液；
15、（d）在aunp@pda@ag懸液中添加4-mba，劇烈攪拌，制得aunp@pda@agmba懸液；
16、（e）將鏈霉親和素溶液和aunp@pda@agmba懸液混合后室溫孵育，然后加入peg-2000和bsa溶液0℃-4℃下孵育，0℃-4℃下10000r/min離心30min獲得aunp@pda@agmba-sa。
17、步驟（b）-（d）中，還包括純化、重懸浮步驟：反應(yīng)液離心后去上清液，沉淀以水洗滌離心；所述離心速度為8000r/min；沉淀加入水或緩沖液進行重懸浮。
18、優(yōu)選地，為了均勻懸浮，所述aunp@pda@agmba-sa重懸于重懸液獲得懸液。所述重懸液包括3wt%bsa、2wt%pvp-10、2wt%peg-20000、0.36wt%tris、0.2wt%tween-20和10wt%海藻糖。
19、氯金酸和三水合檸檬酸鈉的質(zhì)量比為1:1.0-1.5。
20、氯金酸和鹽酸多巴胺的質(zhì)量比為1:10-15；所述h2o2和鹽酸多巴胺的質(zhì)量比為1:2。
21、氯金酸和銀氨溶液中ag的質(zhì)量比為1:10；所述pvp-10和銀氨溶液中ag的質(zhì)量比為1:20。
22、銀氨溶液中ag和4-mba的質(zhì)量比為1:0.03-0.05。
23、氯金酸和鏈霉親和素的質(zhì)量比為1:0.002；鏈霉親和素、peg-2000和bsa和質(zhì)量比為1:100:100。
24、一種定量檢測腸炎沙門氏菌的側(cè)流層析試劑盒，包括腸炎沙門氏菌rpa引物組和側(cè)流層析試紙條；
25、所述腸炎沙門氏菌rpa引物組的上、下游引物的核苷酸序列分別如seq?id?no:1和2所示；其中，上游引物的5’端修飾生物素；下游引物的5’端修飾digoxin；
26、所述側(cè)流層析試紙條上包被拉曼標簽鏈霉親和素、digoxin抗體和鏈霉親和素抗體。
27、所述側(cè)流層析試紙條包括：pvc背板和在背板上依次粘貼的樣品墊、結(jié)合物釋放墊、硝化纖維素膜（nc膜）和吸收墊；所述結(jié)合物釋放墊包被拉曼標簽鏈霉親和素；所述硝化纖維素膜（nc膜）上設(shè)有檢測線（t線）和控質(zhì)線（c線）；所述t線和c線分別固定digoxin抗體本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種拉曼標簽鏈霉親和素，其特征在于，由內(nèi)到外依次為金納米顆粒內(nèi)核，包裹金納米顆粒的聚多巴胺外殼，包裹外殼的鏈霉親和素粘附層；所述聚多巴胺外殼附著連接4-羧基苯硫酚基的Ag顆粒；所述粘附層包含PEG-2000、胎牛血清和鏈霉親和素；所述金納米顆粒為球形，粒徑為20nm-30nm；所述聚多巴胺外殼厚度為3nm-5nm；所述聚多巴胺外殼上Ag顆粒的粒徑為3nm-5nm。
2.一種如權(quán)利要求1所述的拉曼標簽鏈霉親和素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（b）-（d）中，還包括純化、重懸浮步驟：反應(yīng)液離心后去上清液，沉淀以水洗滌離心；所述離心速度為8000r/min；沉淀加入水或緩沖液進行重懸浮；
5.一種如權(quán)利要求1所述的拉曼標簽鏈霉親和素在的制備側(cè)向?qū)游鲈嚰堉械膽?yīng)用，其特征在于，所述側(cè)向?qū)游鲈嚰埖臋z測物上結(jié)合生物素。
6.一種定量檢測腸炎沙門氏菌的側(cè)流層析試劑盒，其特征在于，包括腸炎沙門氏菌RPA引物組和側(cè)流
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的側(cè)流層析試劑盒，其特征在于，所述側(cè)流層析試紙條包括：PVC背板和在背板上依次粘貼的樣品墊、結(jié)合物釋放墊、硝化纖維素膜和吸收墊；所述結(jié)合物釋放墊包被拉曼標簽鏈霉親和素；所述硝化纖維素膜上設(shè)有檢測線和控質(zhì)線；所述檢測線和控質(zhì)線分別固定Digoxin抗體和鏈霉親和素抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的側(cè)流層析試劑盒，其特征在于，所述T線和C線分別固定0.025mg/cm?Digoxin抗體和0.025mg/cm鏈霉親和素抗體；
9.一種利用如權(quán)利要求6-8任一所述的試劑盒檢測腸炎沙門氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述目視定性檢測的方法包括：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種拉曼標簽鏈霉親和素，其特征在于，由內(nèi)到外依次為金納米顆粒內(nèi)核，包裹金納米顆粒的聚多巴胺外殼，包裹外殼的鏈霉親和素粘附層；所述聚多巴胺外殼附著連接4-羧基苯硫酚基的ag顆粒；所述粘附層包含peg-2000、胎牛血清和鏈霉親和素；所述金納米顆粒為球形，粒徑為20nm-30nm；所述聚多巴胺外殼厚度為3nm-5nm；所述聚多巴胺外殼上ag顆粒的粒徑為3nm-5nm。
2.一種如權(quán)利要求1所述的拉曼標簽鏈霉親和素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（b）-（d）中，還包括純化、重懸浮步驟：反應(yīng)液離心后去上清液，沉淀以水洗滌離心；所述離心速度為8000r/min；沉淀加入水或緩沖液進行重懸浮；
5.一種如權(quán)利要求1所述的拉曼標簽鏈霉親和素在的制備側(cè)向?qū)游鲈嚰堉械膽?yīng)用...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姬丹丹，袁赟，
申請(專利權(quán))人：齊魯工業(yè)大學山東省科學院，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。