【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測領域，具體涉及一種穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法及其應用。
技術介紹
1、近年來，抗體偶聯藥物(antibody-drug?conjugate，adc)的相關研究和申報逐漸增多。adc藥物由抗體、連接子(linker)和小分子毒素(payload)組成，既有抗體的高度靶向性，又具有化學藥物的高細胞毒性殺傷力的優勢，在治療腫瘤、自身免疫病中發揮著巨大作用，被廣泛應用于臨床治療和生物醫學研究領域。
2、在眾多小分子毒素中，喜樹堿類小分子毒素因其中低毒性，更好的旁觀者效應以及更快的體內代謝引發國內外眾多開發改造的熱潮。喜樹堿是從中藥喜樹中分離得到的一種單體有效成分，喜樹堿及其多種衍生物是臨床常用的廣譜抗癌藥物，并開發出拓撲替康、依立替康、貝洛替康等喜樹堿類抗癌藥。喜樹堿類藥物一個重要問題是在生理條件下不穩定，其內酯環結構具有ph依賴性，因此保持喜樹堿類藥物活性的關鍵是保護其內酯結構，避免水解失活。其次，半胱氨酸偶聯常用的馬來酰亞胺連接子結合抗體上的巰基偶聯可以實現抗體點位選擇性修飾。然而，研究表明，硫代琥珀酰亞胺五元環中c-n鍵在堿性ph下穩定性不足，會開環水解，水解后穩定性大大提高，減少毒性藥物過早釋放。因此，對于馬來酰亞胺-喜樹堿類adc藥物(如圖1所示)，需要調節制劑緩沖液的ph，從而達到馬來酰亞胺五元環連接子開環，而喜樹堿內酯環閉環的藥物穩定性效果。
3、毛細管等電聚焦電泳(capillary?isoelectric?focusing，cief)是一種基于等電點pi差異
4、目前，生物醫藥領域中針對抗體偶聯藥物尤其是半胱氨酸-馬來酰亞胺-喜樹堿類adc藥物的成熟方法非常缺乏，方法開發難度大，耐用性差，為adc藥物研發和生產帶來挑戰，亟需建立一套成熟完整的以半胱氨酸-馬來酰亞胺-喜樹堿類毒素小分子組成的電荷異質體含量分析技術，用于支持adc藥物電荷異質體含量測定，提高該類抗體偶聯藥物分子分析的準確性，加速大分子藥物的研發效率，并推廣應用到多種類型的抗體偶聯藥物電荷異質性分析。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法及其應用。本專利技術通過設置樣品與預混液的孵育和控制ph的步驟，解決了傳統喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析時譜峰漂移，峰形變化，難以準確定量等問題。所述喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法具有良好的專屬性、重復性、準確度、線性和方法耐用性；所述方法分離度高、樣本用量少、溶液穩定性好。
2、為達到此專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供一種穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，所述方法包括：
4、(a)上樣溶液配制：將甲基纖維素、兩性電解質、等電點標記物和蛋白促溶劑溶解混合，采用酸溶液調節ph值為4.0-6.0；將所得溶液與喜樹堿類adc藥物混合，孵育，得到上樣溶液；
5、(b)電泳儀測試：采用毛細管等電聚焦電泳儀對上樣溶液進行等電聚焦，聚焦完成后得到電荷異質性分析圖譜；
6、(c)數據分析：對不同成分譜圖進行分組并積分，分組包括：酸性峰區域、主峰區域和堿性峰區域；根據總峰面積百分比計算樣品中各組分的電荷異質體含量。
7、本專利技術中，采用酸溶液調節ph值為4.5-6.0，例如可以是4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0等。
8、本專利技術提供了一種針對穩定半胱氨酸-馬來酰亞胺-喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，提高該類抗體偶聯藥物分子分析的準確性，加速該類藥物的研發效率。通過加入酸溶液調節預混液ph和優化孵育時間的方法解決了傳統喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析時譜峰漂移，峰形變化，難以準確定量等問題。該喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法具有良好的專屬性、重復性、準確度、線性和方法耐用性。分離度高、樣本用量少、溶液穩定性佳。
9、本專利技術中，采用酸溶液調節ph值為4.5-6.0，該ph范圍為喜樹堿閉環范圍，在該ph范圍內有利于穩定喜樹堿及其他內酯環；高于該ph范圍，喜樹堿會處于開閉環轉換狀態，最終方法不穩定，低于該ph藥物中的蛋白可能會發生變性，不利于分析。
10、優選地，步驟(a)中，所述兩性電解質包括寬區間兩性電解質和/或窄區間兩性電解質。
11、優選地，所述寬區間兩性電解質選自：pharmelyte?3-10或servalyt?2-11；優選為pharmelyte?3-10。
12、優選地，所述窄區間兩性電解質選自：pharmelyte?8-10.5、pharmalyte?4-6.5、pharmelyte?5-8、pharmalyte?2.5-5、servalyt?3-7、servalyt?6-9或servalyt?7-9；優選為pharmelyte?8-10.5。
13、優選地，所述寬區間兩性電解質在上樣溶液中的體積比為1-4％，例如可以是1％、2％、3％或4％等。
14、優選地，所述窄區間兩性電解質在上樣溶液中的體積比為0-3％，例如可以是0％、1％、2％或3％等。
15、本專利技術中使用的兩性電解質是一種多氨基多羥基兩性化合物組成的混合物。毛細管兩端被施加電壓時，兩性電解質在毛細管內形成一定范圍的ph梯度。利用不同蛋白質所帶電荷不同，蛋白質會在梯度中向陰極或陽極移動，直到靜電荷為0的特定ph(等電點)。
16、優選地，步驟(a)中，所述蛋白促溶劑選自：simplesol、尿素、甘油、蔗糖或乙基脲中任意一種或至少兩種的組合。
17、優選地，所述蛋白促進劑為尿素、甘油、蔗糖或乙基脲中任意一種或至少兩種的組合時，其在上樣溶液中的摩爾濃度小于等于10mol/l，例如可以是1mol/l、2mol/l、3mol/l、4mol/l、5mol/l、6mol/l、7mol/l、8mol/l、9mol/l或10mol/l等，優選為2.5-3.5mol/l，例如可以是2.5mol/l、2.6mol/l、2.7mol/l、2.8mol/l、2.9mol/l、3.0mol/l、3.1mol/l、3.2mol/l、3.3mol/l、3.4mol/l或3.5mol/l等。
18、優選地，所述蛋白促進劑包含simplesol時，simplesol在上樣溶液中的體積分數為0-50％，例如可以是0％、5％、10％、15％、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(A)中，所述兩性電解質包括寬區間兩性電解質和/或窄區間兩性電解質；
3.根據權利要求1或2所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(A)中，所述蛋白促溶劑選自：simplesol、尿素、甘油、蔗糖或乙基脲中任意一種或至少兩種的組合；
4.根據權利要求1-3中任一項所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(A)中，所述等電點標記物包括：低等電點標記物和高等電點標記物；
5.根據權利要求4所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，所述低等電點標記物在上樣溶液中的體積比為0.1-0.6％；
6.根據權利要求1-5中任一項所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(A)中，所述甲基纖維素以甲基纖維素溶液的形式用于配制上樣溶液，所述上樣溶液中甲基纖維素溶液的體積分數為35-
7.根據權利要求1-6中任一項所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(A)中，所述酸溶液選自醋酸溶液或檸檬酸溶液，所述酸溶液調節pH值為4.5-6.0，優選為4.5-6.0。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(A)中，所述喜樹堿類ADC藥物在上樣溶液中的終濃度為0.1-1.0mg/mL。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(A)中，所述孵育的溫度為2-28℃，孵育時間為0.1-24h。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(B)中，所述等電聚焦的聚焦電壓為3000V，聚焦時間為8-20min，樣品盤溫度為5-15℃，所述等電聚焦前的預聚焦電壓為1500V，預聚焦時間為1-2min。
11.權利要求1-10中任一項所述的穩定喜樹堿類ADC藥物的電荷異質性分析方法在抗體偶聯藥物電荷異質性分析中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(a)中，所述兩性電解質包括寬區間兩性電解質和/或窄區間兩性電解質；
3.根據權利要求1或2所述的穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(a)中，所述蛋白促溶劑選自：simplesol、尿素、甘油、蔗糖或乙基脲中任意一種或至少兩種的組合；
4.根據權利要求1-3中任一項所述的穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(a)中，所述等電點標記物包括：低等電點標記物和高等電點標記物；
5.根據權利要求4所述的穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，所述低等電點標記物在上樣溶液中的體積比為0.1-0.6％；
6.根據權利要求1-5中任一項所述的穩定喜樹堿類adc藥物的電荷異質性分析方法，其特征在于，步驟(a)中，所述甲基纖維素以甲基纖維素溶液的形式用于配制上樣溶液，所述上樣溶液中甲基纖維素溶液的體積分數為35-40％；所述甲基纖維素...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張婷婷，李文，張亞楠，莊英瀅，田橙，李志國，
申請(專利權)人：上海藥明合聯生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。