【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥工程，具體涉及一種對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶表面突變體及應用。
技術介紹
1、香豆素(1,2-苯并吡喃酮)是重要的次級代謝產物，大量存在于植物、真菌和細菌等各種生物體內。由于特殊的結構，香豆素衍生物被發現具有多種生物活性，包括抗病毒、抗癌、抗高血壓、抗高尿酸、抗菌、抗炎及抗凝血。此外，香豆素還具有獨特的熒光特性。因此，香豆素類化合物被廣泛應用在香料和化妝品、染料、抗氧化試劑等，是國內外化工和制藥行業研究熱點。
2、在植物和細菌的新陳代謝過程中，碳源可經過莽草酸代謝途徑后可轉化為l-酪氨酸，l-酪氨酸經酪氨酸解氨酶(tal)催化轉化為對香豆酸(p-ca)。以對香豆酸為原料，與對香豆酰輔酶a連接酶(4cl)和對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶(c2’h)結合進行傘形酮的生物合成。傘形酮通過一系列衍生反應，如羥基化、糖基化和異戊烯基化等可以合成各種高附加值香豆素類化合物，所以，傘形酮是香豆素類化合物合成中重要的平臺化合物之一，是合成其他香豆素類化合物的關鍵。如，cn?113930352?a公開了一株產傘形酮和歐芹酚的工程菌及其構建方法和應用，該專利申請中公開了傘形酮的生物合成路徑。
3、現有技術中雖然公開了傘形酮是香豆素類化合物合成中重要的平臺化合物的生物合成路徑，但是其還存在生物合成產率低等問題；而且現有技術中關于瑞香素的生物合成路徑鮮有報道。
技術實現思路
1、經研究，對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶(c2’h)為生物合成香豆素類化合物的限速酶。
2、本專利技術的主要目的之二在于利用上述對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶表面突變體在生物合成香豆素類化合物中的應用，如，傘形酮、瑞香素等香豆素類化合物，有利于實現香豆素類化合物的高效生物合成，尤其是有利于實現以簡單碳源為源頭，從頭高效合成香豆素類化合物。其中，本專利技術中的“簡單碳源”是指單糖、二糖或其任意組合。
3、具體地，本專利技術提供的技術方案如下：
4、一種對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶(c2’h)表面突變體，主要是由seq?id?no.1所示的氨基酸序列發生氨基酸突變得到的，包括以下至少一種氨基酸突變：a159k、e186k。其中，突變體a159k代表第159位的丙氨酸突變為賴氨酸，突變體e186k代表第186位的谷氨酸突變為賴氨酸。
5、所述氨基酸突變可以為單突變或雙突變。優選地，所述對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶突變體為a159k-e186k的雙突變體，即a159k和e186k兩個位點同時突變，第159位的丙氨酸突變為賴氨酸的同時，第186位的谷氨酸突變為賴氨酸。
6、所述對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶(c2’h)來源于甘薯ipomoea?batatas。
7、上述對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶表面突變體的獲得方法，具體包括：通過定點突變的方法設計對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶基因突變體；c2’h通過純化蛋白和體外酶活實驗測量對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶表面突變體的酶活。
8、一種編碼上述對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶(c2’h)表面突變體的基因。
9、一種重組質粒，該重組質粒連接有上述基因。優選地，所述質粒包括但不限于petduet-1、pze12-luc、pcs27或psa74。
10、一種上述對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶表面突變體在生物合成香豆素類化合物中的應用。其中，所述香豆素類化合物可以為傘形酮或瑞香素等。
11、一種合成香豆素類化合物的工程菌，包括宿主菌和轉化到所述宿主菌的上述重組質粒。其中，所述宿主菌為非植物細胞。優選地，所述宿主菌為原始或改造過的細菌、原始或改造過的真菌；例如原始或改造的大腸桿菌(escherichia?coli)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)或畢赤酵母(pichia?pastoris)等。更優選地，所述宿主菌可以為大腸桿菌bw25113；進一步更優選地，所述大腸桿菌為bw25113δpyka/f::arogfbr::tyrafbr；如此敲除了丙酮酸激酶、解除了反饋抑制的磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚酸醛縮酶arogfbr以及分支酸變位酶/預苯酸脫氫酶tyrafbr，能夠提高由莽草酸途徑合成酪氨酸的產量，從而實現增強上游途徑的方式提高合成香豆素類化合物的工程菌從頭合成香豆素類化合物的產量。
12、基上所述的工程菌，所述重組質粒中還同時連接有編碼酪氨酸解氨酶(tal)、對香豆酰-輔酶a連接酶(4cl)和香豆素合成酶(cosy)的基因，如此，所述工程菌為傘形酮合成工程菌，能實現高效合成傘形酮；尤其是能實現以簡單碳源為源頭，從頭高效合成傘形酮。另外，所述傘形酮合成工程菌為簡單香豆素合成工程菌，以其為出發菌可以構建瑞香素合成工程菌。
13、基上所述的工程菌，所述重組質粒中還同時連接有編碼東莨菪素-8-羥化酶(s8h)的基因，如此所述工程菌為瑞香素合成工程菌，能實現高效合成瑞香素；尤其是能實現以簡單碳源為源頭，從頭高效合成瑞香素。
14、在本專利技術中，所述酪氨酸解氨酶(tal)優選地來源于類球紅細菌rhodobactersphaeroides、粘紅酵母r.glutinis、白色鏈霉菌streptomyces?albus、莢膜紅桿菌rhodobacter?capsulatus或棘孢小單孢菌micromonospora?echinofusca等；所述對香豆酰-輔酶a連接酶(4cl)優選地來源于擬南芥arabidopsis?thaliana或歐芹petroselinumcrispum等。所述香豆素合成酶(cosy)源于擬南芥a.thaliana、馬鈴薯solanum?tuberosum或大豆glycine?max等。所述東莨菪素-8-羥化酶(s8h)來源于擬南芥arabidopsisthaliana。
15、一種合成瑞香素的工程菌，包括宿主菌和導入所述宿主菌中的編碼關鍵酶的基因，所述關鍵酶包括酪氨酸解氨酶(tal)、對香豆酰-輔酶a連接酶(4cl)、對香豆酰輔酶a2’-羥化酶(c2’h)、香豆素合成酶(cosy)和東莨菪素-8-羥化酶(s8h)。
16、一種香豆素類化合物的生物合成方法，包括：按照體積分數1％～10％的接種量，將上述合成香豆素類化合物的工程菌接種到發酵培養基中進行發酵培養，得到香豆素類化合物的步驟。其中，所述接種量優選為2％～5％；所述發酵溫度優選為30℃～40℃進行發酵處理；所述發酵培養基優選地包括：0.5～1.5g/l?feso4、1～5g/l?mops、5～20g/l碳源、1～5g/l酵母粉、5～8g/l?na2hpo4、0.3～本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種對香豆酰輔酶A?2’-羥化酶表面突變體，其特征在于：主要是由SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列發生氨基酸突變得到的，包括以下至少一種氨基酸突變：A159K、E186K；
2.一種編碼權利要求1所述的對香豆酰輔酶A?2’-羥化酶表面突變體的基因。
3.一種重組質粒，其特征在于：它連接有權利要求2所述的基因；
4.一種合成香豆素類化合物的工程菌，其特征在于：包括宿主菌和轉化到所述宿主菌的權利要求3所述的重組質粒；
5.根據權利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述重組質粒中還同時連接編碼酪氨酸解氨酶、對香豆酰-輔酶A連接酶和香豆素合成酶的基因；
6.根據權利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述重組質粒中還同時連接編碼東莨菪素-8-羥化酶的基因；
7.一種香豆素類化合物的生物合成方法，包括：按照體積分數1%～10%的接種量，將權利要求4～6任一項所述的工程菌接種到發酵培養基中進行發酵培養，得到香豆素類化合物；
8.根據權利要求7所述的合成方法，其特征在于：所述發酵培養基包括：0.5～1.5?g
9.根據權利要求7或8所述的合成方法，其特征在于：還包括先向所述發酵培養基中添加中間化合物，再對所述工程菌進行發酵培養的步驟；
10.一種合成瑞香素的工程菌，其特征在于：包括宿主菌和導入所述宿主菌中的編碼關鍵酶的基因，所述關鍵酶包括酪氨酸解氨酶、對香豆酰-輔酶A連接酶、對香豆酰輔酶A?2’-羥化酶、香豆素合成酶和東莨菪素-8-羥化酶。
...【技術特征摘要】
1.一種對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶表面突變體，其特征在于：主要是由seq?id?no.1所示的氨基酸序列發生氨基酸突變得到的，包括以下至少一種氨基酸突變：a159k、e186k；
2.一種編碼權利要求1所述的對香豆酰輔酶a?2’-羥化酶表面突變體的基因。
3.一種重組質粒，其特征在于：它連接有權利要求2所述的基因；
4.一種合成香豆素類化合物的工程菌，其特征在于：包括宿主菌和轉化到所述宿主菌的權利要求3所述的重組質粒；
5.根據權利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述重組質粒中還同時連接編碼酪氨酸解氨酶、對香豆酰-輔酶a連接酶和香豆素合成酶的基因；
6.根據權利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述重組質粒中還同時連接編碼東莨菪素-8-羥化酶的基因；
7.一種香豆素類化合物的生物合成方法，包括：按照體積...
【專利技術屬性】
技術研發人員：袁其朋，孫新曉，謝沖，申曉林，王佳，
申請(專利權)人：北京化工大學，
類型：發明
國別省市：
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