【技術實現步驟摘要】
本申請涉及測序領域，特別是涉及一種檢測切除試劑對核酸損傷力的方法及應用。
技術介紹
1、現有的二代測序技術(sequencing?by?synthesis，sbs)中，代表性的是illumina公司的sbs測序技術，其以檢測熒光信號的方法來實現dna序列中4種堿基(腺嘌呤a、鳥嘌呤g、胞嘧啶c和胸腺嘧啶t)的鑒定和區分。具體來說，這些方法使用帶熒光基團和阻斷基團的dntp(datp、dctp、dgtp、dttp)，并且datp、dctp、dgtp、dttp分別攜帶不同的熒光基團。目前基于sbs的測序方法包括以下三個步驟：1、合成反應：在聚合酶作用下，將帶有熒光基團以及阻斷基團的dntps添加到測序合成鏈的3′端；2、信號采集：聚合反應結束后，光學成像系統會對采集其熒光信號；3、切除反應：信號采集完成后，會加入合適的切除試劑，將熒光基團以及阻斷基團從dntps上切下來，使得dntps回到天然狀態，進入下一個循環。
2、由于阻斷基團的存在，發生dna聚合反應時，在每個dna模板上都只會添加一種互補的dntp，通過相應波段的激發光激發后便能檢測出本輪次添加的dntp類型，隨后用合適的化學試劑可將阻斷基團進行切除，使得測序反應能夠正常進入下一個輪次的化學反應。
3、傳統技術中需要通過上機測序來對比不同切除試劑的切除效果；測序時間較長，試劑成本較高；儀器設備成本高，操作要求高，結果分析較復雜。因此，亟需一種高效、快速地檢測切除試劑對核酸損傷力的方法。
技術實現思路
1
2、本申請解決上述技術問題的技術方案如下：
3、本申請一實施方式提供了一種檢測切除試劑對核酸損傷力的方法，包括以下步驟：
4、提供待測切除試劑、阻斷基團切除劑和陰性對照試劑；
5、分別使用所述的待測切除試劑、阻斷基團切除劑和陰性對照試劑切除含有阻斷基團的核酸，得到待測切除產物、陽性對照切除產物和陰性對照切除產物；
6、分別對所述的待測切除產物、陽性對照切除產物和陰性對照切除產物進行凝膠電泳檢測條帶灰度值，相應獲得待測灰度值、陽性灰度值和陰性灰度值；
7、根據所述待測灰度值相對于所述陽性灰度值和所述陰性灰度值的高低，確定所述待測切除試劑對核酸是否具有損傷力，以及進一步確定所述待測切除試劑對核酸損傷力的強弱。
8、本申請通過對待測切除試劑在液相里先進行測試，測試待測切除試劑對核酸分子的損傷程度，可以在不上機測序的情況下快速對比不同的切除試劑的切除效果，節省時間，以高效、快速地確定待測切除試劑對核酸損傷力，反映或指導更好的切除試劑配方，對于測序質量的提升有重要作用。
9、在其中一個實施例中，確定所述待測切除試劑對核酸是否具有損傷力，包括：若所述陽性灰度值＜所述待測灰度值＜所述陰性灰度值，確定所述待測切除試劑對核酸具有損傷力。
10、在其中一個實施例中，確定所述待測切除試劑對核酸的損傷力的強弱包括：若所述待測灰度值越低，切除試劑對核酸的損傷力越強，反之越弱。
11、在其中一個實施例中，所述待測切除試劑包括抗氧化物、tris緩沖劑、可溶性鹽、edta、tween-20和阻斷基團切除劑。
12、在其中一個實施例中，在所述待測切除試劑中，所述抗氧化物的濃度為1mm～20mm、所述tris緩沖劑的濃度為50mm~100mm、所述可溶性鹽的濃度為500mm~1000mm、所述edta的濃度為1mm~15mm、所述tween-20的質量百分含量為0.01%~0.1%、所述阻斷基團切除劑的濃度為10mm~100mm。
13、在其中一個實施例中，所述抗氧化物包括維生素c鈉、d-甘露醇、褪黑素、羥胺、n-乙酰-l-半胱氨酸、n,n-二乙基羥胺和dabco中的至少一種；和/或
14、所述可溶性鹽包括銨鹽、鎂鹽和鈉鹽中的至少一種；和/或
15、所述阻斷基團切除劑包括thpp。
16、在其中一個實施例中，所述切除的溫度為50℃~65℃；和/或
17、所述待測切除試劑的ph為7.0~9.5；和/或
18、所述凝膠電泳包括瓊脂糖凝膠電泳和/或聚丙烯酰胺凝膠電泳；和/或
19、所述陽性對照切除試劑包括50mm~100mmthpp溶液；和/或
20、所述陰性對照試劑包括水。
21、本申請還提供一種切除試劑，所述切除試劑包括抗氧化物、tris緩沖劑、可溶性鹽、edta、tween-20和阻斷基團切除劑。
22、在其中一個實施例中，在所述待測切除試劑中，所述抗氧化物的濃度為1mm～20mm、所述tris緩沖劑的濃度為50mm~100mm、所述可溶性鹽的濃度為500mm~1000mm、所述edta的濃度為1mm~15mm、所述tween-20的質量百分含量為0.01%~0.1%、所述阻斷基團切除劑的濃度為10mm~100mm。
23、在其中一個實施例中，所述抗氧化物包括維生素c鈉、d-甘露醇、褪黑素、羥胺、n-乙酰-l-半胱氨酸、n,n-二乙基羥胺和dabco中的至少一種；和/或
24、所述可溶性鹽包括銨鹽、鎂鹽和鈉鹽中的至少一種；和/或
25、所述阻斷基團切除劑包括thpp。
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1.一種檢測切除試劑對核酸損傷力的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，確定所述待測切除試劑對核酸是否具有損傷力，包括：若所述陽性灰度值＜所述待測灰度值＜所述陰性灰度值，確定所述待測切除試劑對核酸具有損傷力。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，確定所述待測切除試劑對核酸的損傷力的強弱包括：若所述待測灰度值越低，切除試劑對核酸的損傷力越強，反之越弱。
4.如權利要求1~3任一項所述的方法，其特征在于，所述待測切除試劑包括抗氧化物、Tris緩沖劑、可溶性鹽、EDTA、Tween-20和阻斷基團切除劑。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，在所述待測切除試劑中，所述抗氧化物的濃度為1mM～20mM、所述Tris緩沖劑的濃度為50mM~100mM、所述可溶性鹽的濃度為500mM~1000mM、所述EDTA的濃度為1mM~15mM、所述Tween-20的質量百分含量為0.01%~0.1%、所述阻斷基團切除劑的濃度為10mM~100mM。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗氧
7.如權利要求1~3、5~6任一項所述的方法，其特征在于，所述切除的溫度為50℃~65℃；和/或
8.一種切除試劑，其特征在于，所述切除試劑包括抗氧化物、Tris緩沖劑、可溶性鹽、EDTA、Tween-20和阻斷基團切除劑。
9.如權利要求8所述的切除試劑，其特征在于，在所述待測切除試劑中，所述抗氧化物的濃度為1mM～20mM、所述Tris緩沖劑的濃度為50mM~100mM、所述可溶性鹽的濃度為500mM~1000mM、所述EDTA的濃度為1mM~15mM、所述Tween-20的質量百分含量為0.01%~0.1%、所述阻斷基團切除劑的濃度為10mM~100mM。
10.如權利要求8~9任一項所述的切除試劑，其特征在于，所述抗氧化物包括維生素C鈉、D-甘露醇、褪黑素、羥胺、N-乙酰-L-半胱氨酸、N,N-二乙基羥胺和DABCO中的至少一種；和/或
...【技術特征摘要】
1.一種檢測切除試劑對核酸損傷力的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，確定所述待測切除試劑對核酸是否具有損傷力，包括：若所述陽性灰度值＜所述待測灰度值＜所述陰性灰度值，確定所述待測切除試劑對核酸具有損傷力。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，確定所述待測切除試劑對核酸的損傷力的強弱包括：若所述待測灰度值越低，切除試劑對核酸的損傷力越強，反之越弱。
4.如權利要求1~3任一項所述的方法，其特征在于，所述待測切除試劑包括抗氧化物、tris緩沖劑、可溶性鹽、edta、tween-20和阻斷基團切除劑。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，在所述待測切除試劑中，所述抗氧化物的濃度為1mm～20mm、所述tris緩沖劑的濃度為50mm~100mm、所述可溶性鹽的濃度為500mm~1000mm、所述edta的濃度為1mm~15mm、所述tween-20的質量百分含量為0.01%~0.1%、所述阻斷基團切除劑的濃度為10mm~100mm。
6.如權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉金枝，李漢東，危林耿，鄒艷，楊帥，
申請(專利權)人：深圳市大道測序生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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