【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥領域，具體涉及一種麻鴨胚胎成纖維細胞系及其構建方法與應用。
技術介紹
1、家禽業在我國的養殖生產中占據重要地位，并已成為我國農村經濟主要支柱產業。2014-2019年全國家禽存欄量在60億只左右波動；2020年全國家禽產能規模大幅提升，家禽存欄量67.8億只，比上年末增加2.6億只，同比增長3.99％。隨著現代專業化、集約化、規?；B禽技術的不斷推進，我國已成為全球養禽大國，但伴隨著規模的擴大，禽病的問題也日益凸顯出來，一些重大家禽疫病仍是影響成活率和養殖效益、阻礙國內家禽業健康發展的關鍵因素之一。因此，重大家禽疫病的新型疫苗研發意義重大。
2、細胞基質的選擇是疫苗研發的重要一環。在生產中，細胞基質給病毒提供營養，以便病毒大量增殖，進而為制備疫苗提供原料。目前在疫苗生產中常用的細胞基質種類分為原代細胞、二倍體細胞、傳代細胞等。原代細胞的優點在于獲取方便，但容易受到外源性污染，并且因為原代細胞無法連續傳代，需多次制備細胞，批次之間的差異大，細胞均一性控制難度大。二倍體細胞與原代細胞相比，具有連續傳代的能力。而傳代細胞來源于動物，如bhk細胞、mdck細胞，具有無限傳代、容易培養、容易放大等特性，生產成本相對較低。但由于某些傳代細胞來源于腫瘤細胞，存在一定的生物安全風險隱患；另一方面，目前采用的大部分傳代細胞來源為哺乳動物，細胞基質異源性問題會影響禽類疫苗的免疫原性。
3、現階段關于禽源細胞系的研究，僅停留在初步階段，即將動物組織取出后利用胰蛋白酶、紅細胞裂解液等液體反復消化組織塊分離制
技術實現思路
1、本專利技術第一方面的目的，在于提供一種細胞系。
2、本專利技術第二方面的目的，在于提供本專利技術第一方面的細胞系的構建方法。
3、本專利技術第三方面的目的，在于提供麻鴨胚胎成纖維懸浮細胞系在獸用疫苗研發中應用，包括但不限于禽流感h9病毒，新城疫病毒，禽四型腺病毒。
4、本專利技術第四方面的目的，在于提供一種培養病毒的方法。
5、本專利技術第五方面的目的，在于提供一種病毒疫苗的方法。
6、本專利技術第六方面的目的，在于提供一種病毒疫苗。
7、為了實現本專利技術上述的目的，本專利技術采取的技術方案是：
8、本專利技術的第一個方面，提供一株麻鴨胚胎成纖維細胞系，名稱為麻鴨胚胎成纖維懸浮細胞(def-sfs)，于2024年6月28日保藏于位于中國.武漢.武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctcc?no：c2024191。
9、本專利技術的第二個方面，提供本專利技術第一個方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系構建方法，包括以下步驟：
10、1)分離鴨胚的軀干部分，剪碎成組織塊；
11、2)加入第一培養基混勻，培養，傳代10～20代；
12、3)使用無血清培養基培養，傳代5～15代，得到麻鴨胚胎成纖維細胞系。
13、優選地，所述第一培養基包括4～8v/v％胎牛血清、和基礎培養基。
14、優選地，所述基礎培養基包括mem培養基、dmem培養基、dmem/f12培養基中的至少一種。
15、在本專利技術的一些實施方式中，所述構建方法包括：
16、1)def貼壁細胞的分離：于超凈工作臺中將10日齡鴨胚取出，去除頭部等部位，用手術剪刀將軀干部分剪碎，隨后加入少量5v/v％胎牛血清的mem，吹打破碎組織塊，利用300目細胞篩網去除較大團塊，轉入培養瓶中培養，培養條件為37℃，5％co2；
17、2)def貼壁細胞的傳代培養：def原代細胞分離靜止培養6h后，利用不同細胞貼壁速度不一致的原理，將未貼壁細胞及含部分團塊的上清棄去，僅留下已貼壁的細胞，補加新鮮5％胎牛血清的mem，持續培養，細胞長成單層后，采用胰蛋白酶將def消化傳代，持續傳代至15代以上，得到貼壁細胞；
18、3)def無血清懸浮馴化：將采用5v/v％胎牛血清的mem培養的貼壁細胞進行胰蛋白酶消化后，收集細胞懸液，800rpm?5min離心，棄去上清，留下細胞沉淀，用無血清培養基(bsl-01培養基，廣州百賽生物醫藥科技有限公司)重新懸浮，調整細胞密度調整至1.0×106cells/ml，培養條件為37℃，5％co2，130r/min搖床培養，細胞培養48h后，800rpm?5min沉淀細胞，采用新鮮無血清bsl-01培養基重懸，調整細胞密度持續傳代。在細胞無血清馴化中如出現較大細胞粘團，可于超凈工作臺靜置5min，取上清液進行細胞離心傳代，持續培養傳代至25代以上，得到無血清全懸浮培養型麻鴨胚胎成纖維細胞系def-sfs。
19、優選地，步驟1)中所述組織碎塊的大小為1～2cm3/個。
20、優選地，所述培養的條件為31～39℃、4～6％?co2；進一步為33～37℃、5％?co2。
21、本專利技術的第三個方面，在于提供本專利技術第一方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系在1)～8)中任一項中的應用：
22、1)培養病毒；
23、2)制備培養病毒的產品；
24、3)分離病毒；
25、4)制備分離病毒的產品；
26、5)非診斷治療目的地檢測病毒；
27、6)制備檢測病毒的產品；
28、7)制備病毒疫苗；
29、8)藥物篩選；
30、所述藥物為用于預防或治療病毒感染所致的疾病的藥物。
31、優選地，所述病毒包括禽流感病毒、新城疫病毒、和禽腺病毒中的至少一種。
32、優選地，所述禽流感病毒包括h9亞型禽流感病毒。
33、優選地，所述禽腺病毒為禽四型腺病毒。
34、在本專利技術的一些實施方式中，提供本專利技術第一方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系在制備培養禽類病毒的產品中的應用；
35、本專利技術第一方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系在分離禽類病毒中的應用；
36、本專利技術第一方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系在制備分離禽類病毒的產品中的應用；
37、本專利技術第一方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系在非診斷治療目的地檢測禽類病毒中的應用；
38、本專利技術第一方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系在制備檢測禽類病毒的產品中的應用；
39、本專利技術第一方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系在制備禽類疫苗中的應用。
40、本專利技術的第四個方面，提供一種培養病毒的方法，將病毒接種至本專利技術第一個方面的麻鴨胚胎成纖維細胞系中培養。
41、優選地，所述病毒包括禽流感病毒、新城疫病毒、和禽腺病毒中的至少一種。
42、優選地，所述禽流感病毒包括h9亞型禽流感病毒。
43、優選地，所述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一株麻鴨胚胎成纖維細胞系，名稱為麻鴨胚胎成纖維懸浮細胞DEF-Sfs，于2024年6月28日保藏于位于中國.武漢.武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：C2024191。
2.權利要求1所述的麻鴨胚胎成纖維細胞系的構建方法，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于：
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于：
5.權利要求1所述的麻鴨胚胎成纖維細胞系在1)～8)中任一項中的應用：
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：
7.一種培養病毒的方法，將病毒接種至權利要求1所述的麻鴨胚胎成纖維細胞系中，培養。
8.一種制備病毒疫苗的方法，將病毒接種至權利要求1所述的麻鴨胚胎成纖維細胞系中，培養，滅活，得到病毒疫苗。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于：
10.一種病毒疫苗，通過權利要求8或9所述的方法制備得到。
【技術特征摘要】
1.一株麻鴨胚胎成纖維細胞系，名稱為麻鴨胚胎成纖維懸浮細胞def-sfs，于2024年6月28日保藏于位于中國.武漢.武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno：c2024191。
2.權利要求1所述的麻鴨胚胎成纖維細胞系的構建方法，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于：
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于：
5.權利要求1所述的麻鴨胚胎成纖...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱輝，邵寶順，楊義芬，方琳，柳國權，
申請(專利權)人：廣州百賽生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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