腫瘤血管靶向性肽新型腫瘤壞死因子融合蛋白制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因克隆、外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)、目的蛋白質(zhì)的純化、腫瘤血管靶向性肽新型腫瘤壞死因子融合蛋白，其特征在于：應(yīng)用噬菌體肽庫體內(nèi)篩選技術(shù)，得到了能與胃癌血管特異性結(jié)合的噬菌體小肽，將其與新型人腫瘤壞死因子α（ｒｍｈＴＮＦ）融合在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，利用硫酸銨鹽析和陰陽離子交換的方法對目的蛋白進行純化，將得到的目的蛋白進行了活性測試。其既具有新型重組人腫瘤壞死因子高效低毒的優(yōu)點，又能在胃癌組織新生血管處富集，從而進一步降低新型重組人腫瘤壞死因子的臨床用藥量，提高量效比，降低胃癌治療中的毒副作用。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于醫(yī)藥生物
，具體涉及基因克隆、外源基因在原核細(xì)胞中的 表達(dá)、目的蛋白質(zhì)的純化、腫瘤血管靶向性肽新型腫瘤壞死因子融合蛋白。
技術(shù)介紹
腫瘤血管抑制治療相關(guān)研究及存在的問題腫瘤血管生成是腫瘤迅速增殖的前提條件，抑制腫瘤血管生成是腫瘤治療的一 種重要途徑。目前腫瘤血管抑制治療主要分為以下途徑①阻斷促進血管生成的調(diào) 節(jié)因子。血管生長刺激因子VEGF等是腫瘤細(xì)胞中最常發(fā)現(xiàn)的促血管生長因子，也 是血管治療中的主要耙分子。②增強抑制血管生長的調(diào)節(jié)因子。如增強抑制性細(xì)胞 因子、生長因子拮抗劑等是腫瘤血管治療中最直接的手段，目前已有多種抑制調(diào)節(jié) 因子進入臨床前期試驗階段。③已形成血管的阻斷療法。誘導(dǎo)腫瘤組織中已存在的 血管急性損傷能夠有效抑制腫瘤的增殖。④腫瘤血管抑制基因治療。由于基因治療 的目標(biāo)是核酸，具有設(shè)計簡單、特異性強和毒性小等優(yōu)點，目前已廣泛用于實驗研 究中。盡管目前在腫瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之處。首 先，腫瘤血管針對性治療不強。由于檢測腫瘤血管特異性的分子標(biāo)志物存在著很多 困難這些分子只存在于腫瘤血管，正常血管中并不存在；表達(dá)的量較小，難以檢 測，更無法純化。找出腫瘤血管特異性標(biāo)志物是對腫瘤血管進行靶向治療的關(guān)鍵。 其次，目前進入臨床實驗多數(shù)血管生成抑制分子進入體內(nèi)表達(dá)效率低，不能在腫瘤 血管局部維持治療濃度。只有當(dāng)這些抑制血管或者腫瘤生成的藥物具有耙向性的時 候，才能使藥物在體內(nèi)表達(dá)效率增高，治療濃度增大，達(dá)到有效治療。 特異性結(jié)合多肽的研究現(xiàn)狀針對以上的不足，噬菌體隨機肽庫的應(yīng)用成功的解決了這一難題并為人們大規(guī) 模發(fā)展和篩選新型抗腫瘤藥物提供了強有力的手段。隨著噬菌體展示多肽庫技術(shù)的 發(fā)展，應(yīng)用小肽模擬抗原抗體反應(yīng)已成為發(fā)展的趨勢。這是因為(l)含有關(guān)鍵殘基 的短肽能夠模擬蛋白質(zhì)上的抗原決定簇；(2)多數(shù)情況下，幾個關(guān)鍵殘基與它的結(jié)合 分子所形成的非共價鍵構(gòu)成了全部結(jié)合的主要部分，即蛋白質(zhì)之間的相互作用是通 過局部肽段間的相互作用實現(xiàn)的。這類導(dǎo)向性藥物，不僅具有結(jié)合特異性和高效性， 還克服了單抗效應(yīng)劑分子量較大，穿透能力弱的缺點。目前，基于導(dǎo)向藥物中導(dǎo)向 分子小型化的發(fā)展趨勢，利用噬菌體展示多肽庫技術(shù)篩選出能夠與目的分子結(jié)合的 短肽，在體外合成編碼這一短肽的核苷酸序列，與彈頭分子基因融合，表達(dá)出具有 導(dǎo)向作用的多肽一彈頭分子，由短肽發(fā)揮導(dǎo)向作用，彈頭分子可以是細(xì)菌毒素、細(xì) 胞因子、化療藥物等，這一藥物設(shè)計策略已顯示出良好的應(yīng)用前景。已有研究顯示各種組織器官都存在著組織器官特異性親和蛋白，因此不同種類 的腫瘤血管也會有不同的特異性親和蛋白，即異質(zhì)性(Molecular heterogeneity)。 Pasqualini等人也通過噬菌體隨機肽庫體內(nèi)淘洗法并獲得了包括腦、腎、肺、胰、皮 膚等多種正常組織器官血管內(nèi)皮結(jié)合的不同的噬菌體短肽。Wadih Arap等采用噬菌 體隨機肽庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)能夠與前列腺腫瘤血管特異性結(jié)合的小肽SMSIARL。Angelo Coni等利用基因工程手段，將從噬菌體展示肽庫中篩選出的能特異性與 氨肽酶(CD13)結(jié)合的五肽CNGRC通過一個甘氨酸連到天然人腫瘤壞死因子的氨基4端，實驗證明，改建后的融合蛋白在體外腫瘤細(xì)胞殺傷實驗中具有與天然腫瘤壞死,因子相近的活性，在體內(nèi)實驗中，與天然腫瘤壞死因子相比，改建后的融合蛋白具有更高的量效比，更低的毒副反應(yīng)。在移植腫瘤生長12天以后，CNGRC-TNF和TNF 二者的殺傷活性出現(xiàn)明顯差別，說明CNGRC-TNF可能通過作用于腫瘤的新生血管而具有較高的量效比。證實了特異性結(jié)合多肽作為導(dǎo)向分子的合理性和可行性。目前篩選多肽的方法有體內(nèi)篩選和體外篩選兩種，體外篩選主要針對目的腫瘤或組織的細(xì)胞系進行篩選，方法比較簡單，但是無法準(zhǔn)確模擬體內(nèi)環(huán)境，篩選出的多肽在應(yīng)用到體內(nèi)時靶向效果不好。體內(nèi)篩選就彌補了這個不足，體內(nèi)篩選要建出合適的動物模型，方法上比較復(fù)雜，但是其來源于體內(nèi)環(huán)境，應(yīng)用于體內(nèi)時效果較好。腫瘤壞死因子是一種多功能的細(xì)胞因子，參與機體的免疫代謝調(diào)節(jié)，對某些癌細(xì)胞具有增殖抑制和細(xì)胞毒作用。腫瘤壞死因子還是一種感染性介導(dǎo)因子，在機體的炎癥中起重要作用。腫瘤壞死因子的生物效應(yīng)抗腫瘤及抑瘤作用腫瘤壞死因子對多種腫瘤均有殺傷或抑制作用，敏感性因腫瘤細(xì)胞類型而異。腫瘤壞死因子的抑瘤機制尚不完全清楚，可能包括①、腫瘤壞死因子為激發(fā)性細(xì)胞因子，可啟動廣泛的免疫炎性反應(yīng)，介導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對癌細(xì)胞的殺傷作用；②、腫瘤壞死因子可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使腫瘤的血管變形受損或形成血栓，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生出血性壞死或營養(yǎng)缺乏而消退；③、腫瘤壞死因子可通過誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞增生。抗病毒作用腫瘤壞死因子呈劑量依賴性地抑制病毒介導(dǎo)的細(xì)胞病變的發(fā)展，對DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。腫瘤壞死因子可以誘導(dǎo)未感染細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒能力，還可選擇性的殺傷病毒感染的細(xì)胞。現(xiàn)已證實，多種病毒等也可刺激腫瘤壞死因子的產(chǎn)生。免疫調(diào)節(jié)作用腫瘤壞死因子能夠增強T細(xì)胞產(chǎn)生以IL-2為主的淋巴因子，提高IL-2的表達(dá)水平，從而促進T細(xì)胞的增殖；還能促進B細(xì)胞的增殖、分化和產(chǎn)生抗體。此外，腫瘤壞死因子還能誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的前體細(xì)胞分化，增強其吞噬能力和氧化代謝水平，提高巨噬細(xì)胞抗原提呈能力。并可促進骨髓基質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CSF，特別是GM-CSF，可促使骨髓釋放中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。腫瘤壞死因子還可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)，是一種急性期反應(yīng)的強力誘導(dǎo)劑。對結(jié)締組織的作用可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)、促進軟骨細(xì)胞進行軟骨更新，抑制新骨形成。腫瘤壞死因子還可以刺激成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的增生，引起關(guān)節(jié)組織的纖維化和增生。腫瘤壞死因子的應(yīng)用現(xiàn)狀由于腫瘤壞死因子的抗腫瘤作用和多種免疫調(diào)節(jié)作用，腫瘤壞死因子療法的臨床研究已在許多國家開展。動物實驗和臨床研究均表明腫瘤壞死因子對某些腫瘤具有明顯的抑制作用，但是由于副作用較大，限制了它的臨床應(yīng)用。腫瘤壞死因子的副作用包括發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、全身倦怠、肌肉酸痛等；高劑量時可導(dǎo)致休克、腎功能不全和DIC形成等。建立合理的用藥方案及治療措施，可望降低用量，減輕副作用，達(dá)到最佳治療效果。靜脈注射rhTNF可使部分腫瘤縮小，但是副作用大，人體很難耐受。瘤內(nèi)注射可在局部出現(xiàn)壞死，且副作用較輕，對某些腫瘤的治療效果優(yōu)于靜脈注射。已報告的有效病例包括腎癌、胃癌、肝癌等，并使轉(zhuǎn)移性大腸癌腹水減少。腫瘤壞死因子與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用單獨使用TNF用量大，不容易獲得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止用藥。將其它具有腫瘤抑制作用的細(xì)胞因子(如IL-2、 IFN等)或某些抗腫瘤藥物(如ADM、 MMC、 DDP)與TNF聯(lián)合應(yīng)用，既可減少各種藥物的用量、降低毒副作用，又可提高療效，不失為腫瘤治療的一種可行方法。腫瘤壞死因子的定位基因突變:根據(jù)對TNF結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究結(jié)果，對TNF的核苷酸的置換、插入或刪除來定向改變基因的序列，從而達(dá)到使TNF增效減毒的目的。用該法已獲得了大量的TNF衍生物。盡管對腫瘤壞死因子的改構(gòu)或者與其他藥物聯(lián)用可在一定程度上降低其全身毒副作用，但其仍然是作用于全身各個臟器，對本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
腫瘤血管靶向性肽新型腫瘤壞死因子融合蛋白，其特征在于：將合成的胃癌血管特異性結(jié)合的小肽ＧＸ１與新型人腫瘤壞死因子α融合在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，其基因的序列如下：　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　 ＡＡＴ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＴＣＧ　ＴＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＣＧＣ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＧＣＣ　ＣＡＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ 　ＣＡＧ　ＣＴＣ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣ　ＣＧＣ　ＣＧＧ　ＧＣＣ　ＡＡＴ　ＧＣＣ　ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＡＡＴ　ＧＧＣ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＣＡＧ　 　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＣ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＴＣＣ　ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　ＣＡＡ　ＧＧＣ　ＴＧＣ　ＣＣＣ　 ＴＣＣ　ＡＣＣ　ＣＡＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＣＴＣ　ＡＣＣ　ＣＡＣ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＡＧＣ　ＣＧＣ　ＡＴＣ　ＧＣＣ　ＧＴＣ　ＴＣＣ　ＴＡＣ　ＣＡＧ　ＡＣＣ　ＡＡＧ　ＧＴＣ　ＡＡＣ　ＣＴＣ　ＣＴＣ 　ＴＣＴ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＡＧＣ　ＣＣＣ　ＴＧＣ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣ　ＡＡＧ　ＣＣＣ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣ　 　ＡＴＣ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＧＴＣ　ＴＴＣ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＣ　ＣＧＡ　ＣＴＣ　ＡＧＣ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＴ　ＣＧＧ　ＣＣＣ　ＧＡＣ　ＴＡ Ｔ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＴＴＴ　ＧＣＣ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＴＡＣ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣ　ＡＴＴ　ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＣＡＧ。...

【技術(shù)特征摘要】
1、腫瘤血管靶向性肽新型腫瘤壞死因子融合蛋白，其特征在于將合成的胃癌血管特異性結(jié)合的小肽GX1與新型人腫瘤壞死因子α融合在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，其基因的序列如下GAA TTC ATG TGT GGT AAT TCT AAT CCT AAG TCG TGC GGA TCC CGCAAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGGCAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AATGGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGCCTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCCTCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCCTAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAGAGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCCATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGCGCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAGGTC TAC TTT GGGATC ATT GCC TTC TGA CTG CAG2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤血管靶向性肽新型腫瘤壞死因子融合蛋白，其制備方法是1) 合成含有酶切位點的小肽CGNSNPKSC (GXl);2) GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及構(gòu)建；3) 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；4) 重組蛋白的純化；5) 重組蛋白的體外生物學(xué)活性檢測；6) 重組蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性檢測。3、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤血管靶向性肽新型腫瘤壞死因子融合蛋白的制備 方法，其特征在于所述的GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及構(gòu)建中 pBV220-rmhTNF質(zhì)粒，它的克隆位點是EcoRl,BamHl和Pstl;按照大腸桿菌慣用 密碼子設(shè)計并合成了編碼GXl導(dǎo)向肽的含有酶切位點的核酸片斷5'AATTC ATG TGT GGT AAT TCT AAT CCT AAG TCG TGC G3'將合成的片斷于93'...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曹珊珊，吳開春，張英起，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：87[中國|西安]