【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及氨基酸，具體為一種專用氨基酸可激發(fā)身體合成nk細胞的制備方法。
技術介紹
1、近年來，隨著腫瘤免疫治療的迅速發(fā)展，自然殺傷(nk)細胞因其獨特的抗腫瘤和抗病毒能力而受到廣泛關注。nk細胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠在不需要預先致敏的情況下快速識別和殺傷異常細胞。然而，在多種疾病狀態(tài)下，nk細胞的數(shù)量和功能往往受到抑制，限制了其在臨床應用中的效果。因此，開發(fā)能夠有效激活和增強nk細胞功能的制劑成為了當前研究的熱點。
2、現(xiàn)有技術主要集中在以下幾個方面：
3、1.細胞因子治療：如使用il-2、il-15等細胞因子刺激nk細胞增殖和活化。然而，這些方法往往存在系統(tǒng)性毒性高、半衰期短、成本高等問題。
4、2.單克隆抗體：如抗pd-1/pd-l1抗體，雖然在部分患者中顯示出良好效果，但對nk細胞的直接激活作用有限，且存在免疫相關不良反應。
5、3.小分子激活劑：如tlr激動劑，但其特異性不足，可能導致過度的炎癥反應。
6、4.養(yǎng)生保健品：市面上存在許多聲稱能增強nk細胞活性的保健品，但大多缺乏科學依據(jù)和嚴格的質(zhì)量控制。
7、現(xiàn)有技術存在的主要問題：
8、1.特異性不足：大多數(shù)方法無法專一地針對nk細胞，可能同時影響其他免疫細胞，導致不必要的副作用。
9、2.持續(xù)時間短：許多激活劑的作用時間有限，需要頻繁給藥，增加了患者負擔和治療成本。
10、3.生物利用度低：口服制劑往往因胃腸道降解和首過效應而導致活性成分生物
11、4.個體差異大：現(xiàn)有方法對不同個體的反應差異較大，難以實現(xiàn)個性化治療。
12、5.多靶點協(xié)同作用不足：大多數(shù)方法只針對單一靶點或機制，難以實現(xiàn)多方面的免疫增強效果。
13、6.生產(chǎn)工藝復雜：一些先進的治療方法(如car-nk細胞)生產(chǎn)工藝復雜，成本高昂，難以大規(guī)模應用。
14、7.穩(wěn)定性差：許多生物活性分子在儲存和運輸過程中容易失活，限制了其臨床應用。
15、鑒于上述問題，亟需開發(fā)能夠特異性激活nk細胞、作用持久、生物利用度高、具有多靶點協(xié)同作用、生產(chǎn)工藝簡單、穩(wěn)定性好的新型制劑。本專利技術正是針對這些未解決的技術問題而設計的。
技術實現(xiàn)思路
1、(一)解決的技術問題
2、針對現(xiàn)有技術的不足，本專利技術提供了一種專用氨基酸可激發(fā)身體合成nk細胞的制備方法。
3、(二)技術方案
4、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術提供以下技術方案：一種專用氨基酸可激發(fā)身體合成nk細胞的制備方法。
5、本專利技術公開了一種專用氨基酸可激發(fā)身體合成nk細胞的制備方法，包括以下依次進行的步驟：
6、(1)通過微生物發(fā)酵獲得氨基酸前體，所述微生物為經(jīng)基因工程改造的大腸桿菌菌株；
7、(2)對所述氨基酸前體進行酶催化反應，將其轉(zhuǎn)化為目標氨基酸；
8、(3)采用固相肽合成法合成nk細胞特異性靶向肽；
9、(4)將所述目標氨基酸與所述nk細胞特異性靶向肽進行偶聯(lián)反應；
10、(5)制備包含上述偶聯(lián)產(chǎn)物的納米脂質(zhì)體；
11、(6)將所述納米脂質(zhì)體與緩釋輔料混合，最終制成口服制劑。
12、具體地，所述步驟(1)中的微生物發(fā)酵條件為：
13、在5l發(fā)酵罐中進行，發(fā)酵溫度為37±1℃，ph值為7.0±0.2，溶氧濃度控制在30％以上，攪拌速度為400-600rpm，發(fā)酵時間為48-72小時；
14、所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖35-45g/l，酵母提取物8-12g/l，(nh4)2so4?4-6g/l，kh2po4?2-4g/l，mgso4·7h2o?0.4-0.6g/l。
15、具體地，所述步驟(2)中的酶催化反應包括以下子步驟：
16、(a)離心收集發(fā)酵液，8000g離心15分鐘；
17、(b)超聲破碎菌體，功率為500w，處理時間為5分鐘，再次離心收集上清；
18、(c)向上清中加入特定酶，所述特定酶選自精氨酸脫亞胺酶或谷氨酰胺合成酶，酶的用量為5-10u/ml；
19、(d)在30±1℃條件下反應4-6小時；
20、(e)反應結(jié)束后，95℃加熱5分鐘滅活酶；
21、(f)離心、過濾，收集含目標氨基酸的溶液。
22、具體地，所述步驟(3)中nk細胞特異性靶向肽的合成采用fmoc保護策略的固相肽合成法，所述nk細胞特異性靶向肽的氨基酸序列為cywggtegggk或其功能等同物。
23、具體地，所述步驟(4)中目標氨基酸與nk細胞特異性靶向肽的偶聯(lián)過程包括以下子步驟：
24、(a)將10mmol氨基酸(10mmol)溶于20ml無水dmf中；
25、(b)加入12mmoledc·hc和12mmolnhs，室溫攪拌1小時；
26、(c)將活化的氨基酸溶液滴加到含有9mmol靶向肽的ph為7.4的pbs緩沖液中；
27、(d)室溫反應4小時，然后透析24小時，最后冷凍干燥得到偶聯(lián)產(chǎn)物。
28、具體地，所述步驟(5)中納米脂質(zhì)體的制備包括以下子步驟：
29、(a)將卵磷脂和膽固醇按4:1的重量比溶于10ml氯仿中；
30、(b)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下緩慢蒸發(fā)溶劑，形成薄膜；
31、(c)真空干燥2小時，除去殘留溶劑；
32、(d)加入10ml含有偶聯(lián)產(chǎn)物的ph為7.4的pbs緩沖液；
33、(e)水化1小時，然后超聲處理，功率為100w，間歇模式，處理時間為15分鐘；
34、(f)使用孔徑為200nm的聚碳酸酯膜，擠出15次；
35、(g)10000g離心10分鐘，去除未包封的物質(zhì)。
36、具體地，所述步驟(6)中口服制劑的制備包括以下子步驟：
37、(a)將納米脂質(zhì)體分散液與10-15重量份羥丙甲纖維素混合，攪拌均勻；
38、(b)加入5-8重量份微晶纖維素，繼續(xù)攪拌；
39、(c)真空干燥或冷凍干燥得到粉末；
40、(d)將粉末壓制成片劑或填充入膠囊。
41、具體地，所述的制備方法制得的可激發(fā)身體合成nk細胞的專用氨基酸制劑，所述制劑包含以下重量份的組分：
42、特定氨基酸35-45份；
43、nk細胞特異性靶向肽8-12份；
44、卵磷脂20-25份；
45、膽固醇5-8份；
46、羥丙甲纖維素10-15份；
47、微晶纖維素5-8份。
48、具體地，所述制劑的質(zhì)量指標為：
49、氨基酸純度≥99％，肽純度≥95％，偶聯(lián)率≥90％，脂質(zhì)體粒徑80-150nm，多分散指數(shù)≤0.2，包封率≥80％，體外釋放試本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種專用氨基酸可激發(fā)身體合成NK細胞的制備方法，其特征在于，包括以下依次進行的步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的微生物發(fā)酵條件為：
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的酶催化反應包括以下子步驟：
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中NK細胞特異性靶向肽的合成采用Fmoc保護策略的固相肽合成法，所述NK細胞特異性靶向肽的氨基酸序列為CYWGGTEGGGK或其功能等同物。
5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中目標氨基酸與NK細胞特異性靶向肽的偶聯(lián)過程包括以下子步驟：
6.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中納米脂質(zhì)體的制備包括以下子步驟：
7.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(6)中口服制劑的制備包括以下子步驟：
8.根據(jù)權利要求1-7任一項所述的制備方法制得的可激發(fā)身體合成NK細胞的專用氨基酸制劑，其特征在于，所述制劑包含以下重量份的組分：
9.根據(jù)權利要求8所述的制劑，其特征在于，所述制劑的質(zhì)量指標為：
10.權利要求8或9所述的制劑在制備增強免疫力、輔助癌癥治療的藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種專用氨基酸可激發(fā)身體合成nk細胞的制備方法，其特征在于，包括以下依次進行的步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的微生物發(fā)酵條件為：
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的酶催化反應包括以下子步驟：
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中nk細胞特異性靶向肽的合成采用fmoc保護策略的固相肽合成法，所述nk細胞特異性靶向肽的氨基酸序列為cywggtegggk或其功能等同物。
5.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中目標...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：鄧艷華，鄧軍，黃玉霞，張亮，
申請(專利權)人：樟樹市益康藥業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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