【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學和生物，涉及蜻蜓鳳梨afgf14i基因的克隆、表達載體構建、亞細胞定位及對開花的調控作用。
技術介紹
1、鳳梨科植物(bromeliaceae)是廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區的多年生單子葉植物，共包含58個屬，3000多個種，從用途上可分為食用鳳梨(菠蘿)和觀賞鳳梨。觀賞鳳梨又名鳳梨花或菠蘿花，是僅次于蘭花和紅掌的第三大熱帶花卉，因品種繁多，株型優美，花型奇特，花色艷麗，花期長而深受喜愛。
2、蜻蜓鳳梨(aechmeafasciata)為光萼荷屬(aechmea)觀賞鳳梨，又名白紋蜻蜓珊瑚、斑粉菠蘿或粉菠蘿，是觀賞鳳梨的模式作物。蜻蜓鳳梨的花呈桃紅色，層次開放，花期長達數月，花朵凋謝后，粉紅色的苞片仍可保持數月，因此具有極高的觀賞價值。
3、14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物中的調控蛋白，在不同生物間高度保守。目前已在擬南芥、水稻、芒果、馬鈴薯、棉花、蘋果等多種作物中報道14-3-3蛋白參與調控植物的開花轉變。已有研究表明，14-3-3蛋白作為“銜接分子”，連接成花素flowering?locust(ft)和轉錄因子flowering?locusd(fd)，形成三元復合體—成花素激活復合體(florigenactivation?complex,fac)，激活下游的花分生組織決定基因表達，從而誘導開花。
4、通過蜻蜓鳳梨比較轉錄組信息分析，獲得了14-3-3基因的片段，blast比對顯示與其他植物中14-3-3蛋白家族的gf14iota基因均具有較高的同源性，故命名為
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是提供一種蜻蜓鳳梨afgf14i基因，具體是通過提取蜻蜓鳳梨總rna，反轉錄合成cdna，以此為模板，設計特異引物，利用pcr方法獲得afgf14i基因的全長cds，與載體連接，轉化大腸桿菌trans-t1感受態細胞，挑取陽性克隆得到蜻蜓鳳梨afgf14i基因，該基因的cds全長729bp。
2、為了實現上述目的，本專利技術的技術方案為：提供一種蜻蜓鳳梨afgf14i基因，該基因序列具有序列表中seq?id?no.1所示的核苷酸序列。
3、本專利技術的另一目的在于提供一種蜻蜓鳳梨afgf14i基因的克隆方法，包括以下步驟：
4、(1)以蜻蜓鳳梨(aechemiafasciata)為材料，利用ctab法提取總rna；
5、(2)afgf14i基因的克隆；
6、(2-1)cdna模板合成利用one-step?gdna?removal?and?cdnasynthesis?supermix(transgene)試劑盒，作為pcr模板備用；
7、(2-2)設計全長cds擴增引物；
8、afgf14i基因cds全長克隆引物
9、 引物名稱 序列(5′-3′) tm(℃) afgf14i-f atggagagggagaaccatgt 57.0 afgf14i-r ttattctacattacctccatcctcagg 56.7
10、(2-3)根據引物的tm值進行pcr條件的優化后，進行pcr擴增，并將獲得的產物連接到載體，并轉化大腸桿菌感受態trans-t1，經菌落pcr鑒定后進行測序。
11、pcr體系及條件為：
12、 ingredient amount(μl) 2×taqmastermix 25 forwardprimer(10μm) 2 reverseprimer(10μm) 2 <![cdata[ddh<sub>2</sub>o]]> 20 cdna 1 totalvolume 50
13、
14、獲得全長的cds為729bp，編碼一個具243個氨基酸的序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行比較，表明其具有14-3-3家族保守功能結構域，與己發表的菠蘿、油棕、小粒咖啡gf14iota蛋白的氨基酸同源性分別頭98％、98％、91％。
15、進一步地，步驟(1)總rna的提取具體如下：
16、(1-1)實驗過程中所用研缽需提前進行180℃，5h高溫滅菌，冷卻至室溫后備用，移液槍、實驗臺需用酒精擦拭，離心管、槍頭均無rna酶；
17、(1-2)取850μl?ctab緩沖液于2ml離心管中，65℃水浴預熱；
18、(1-3)稱取約0.2g材料于加有液氮的研缽中充分研磨，待材料研磨成呈粉末狀后即可轉入(1-2)中預熱的ctab緩沖液中，加入材料前，先加入25μlβ-巰基乙醇；
19、(1-4)渦旋30s充分混勻，65℃水浴6min；
20、(1-5)加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，劇烈震蕩，開蓋放氣，渦旋30s，室溫條件下11000rpm離心15min；
21、(1-6)吸取上清于新的2ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)再抽提一次，渦旋30s，室溫11000rpm離心15min；
22、(1-7)吸取上清于新的1.5ml離心管中，加入1/3體積的8m?本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種蜻蜓鳳梨AfGF14i基因，其特征在于：該基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?IDNO.1所示。
2.一種蜻蜓鳳梨AfGF14i基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基因的克隆方法，其特征在于，步驟(1)總RNA的提取具體如下：
4.根據權利要求2所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基因的克隆方法，其特征在于，步驟(2-2)中設計的全長cDNA擴增引物包括AfGF14i-F和AfGF14i-R引物，序列分別如序列表中的SEQ?IDNO.2、SEQ?ID?NO.3所示。
5.一種蜻蜓鳳梨AfGF14i基因表達載體，其特征在于：含有權利要求1所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基因為目的基因的表達載體。
6.根據權利要求5所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基因表達載體，其特征在于：是用權利要求1所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基因連入到植物表達載體CaMV35S-yfp上，構建成在CaMV35S啟動子下游含有蜻蜓鳳梨AfGF14i基因的高效表達載體。
7.根據權利要求6所述的蜻蜓鳳
8.根據權利要求7所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基因表達載體，其特征在于：所述上游引物P1和下游引物P2的序列如序列表中的SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5所示。
9.一種利用權利要求1所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基因編碼蛋白的亞細胞定位方法，其特征在于，通過在煙草葉片上瞬時表達分析AfGF14i基因編碼蛋白的亞細胞定位，將構建好的帶有AfGF14i基因CDS序列的表達載體CaMV35S-AfGF14i-yfp轉入農桿菌EHA105后，注射本氏煙(Nicotiana?benthamiana)煙草葉片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號分布情況，確定AfGF14i蛋白的亞細胞定位，觀察發現AfGF14i蛋白分布于細胞膜。
10.權利要求1～8任何一項所述的蜻蜓鳳梨AfGF14i基在調控南芥植物開花方面的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種蜻蜓鳳梨afgf14i基因，其特征在于：該基因的核苷酸序列如序列表中seq?idno.1所示。
2.一種蜻蜓鳳梨afgf14i基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的蜻蜓鳳梨afgf14i基因的克隆方法，其特征在于，步驟(1)總rna的提取具體如下：
4.根據權利要求2所述的蜻蜓鳳梨afgf14i基因的克隆方法，其特征在于，步驟(2-2)中設計的全長cdna擴增引物包括afgf14i-f和afgf14i-r引物，序列分別如序列表中的seq?idno.2、seq?id?no.3所示。
5.一種蜻蜓鳳梨afgf14i基因表達載體，其特征在于：含有權利要求1所述的蜻蜓鳳梨afgf14i基因為目的基因的表達載體。
6.根據權利要求5所述的蜻蜓鳳梨afgf14i基因表達載體，其特征在于：是用權利要求1所述的蜻蜓鳳梨afgf14i基因連入到植物表達載體camv35s-yfp上，構建成在camv35s啟動子下游含有蜻蜓鳳梨afgf14i基因的高效表達載體。
7.根據權利要求6所述的蜻蜓鳳梨afgf14i基因表達載體，其特征在于：根據已測序的afgf14i基因序列，設計在5’端加上27bp含kpn?i酶切位點的同源...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王小冰，徐立，李志英，楊玉蓉，王加賓，
申請(專利權)人：中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。