【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及干細胞制備領域，具體涉及一種臍帶間充質干細胞制備方法。
技術介紹
1、干細胞(stem?cell)是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。間充質干細胞廣泛分布于胎兒和成體的臍帶、臍帶血、乳牙、骨髓、脂肪、肝中。其中臍帶來源的間充質干細胞因為來源廣泛，采集比較方便，提取制備的細胞細胞活率高，細胞表型穩定，具備較高的臨床應用價值。因此，研究臍帶間充質干細胞制備方法具有重要意義，現有的相關制備方法獲得的制劑樣品，在冷凍保存過程中，細胞活率有待改善。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供一種臍帶間充質干細胞制備方法。
2、為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案為：一種臍帶間充質干細胞制備方法，所述方法包括以下步驟：
3、(1)取健康良好臍帶經貼壁法培養人臍帶間充質干細胞，傳代至p4～p6代后，胰酶替代物或胰蛋白胨酶消化物消化，清洗；
4、(2)將清洗后的人臍帶間充質干細胞加入培養基復合液中，細胞密度為2～10×105/ml；
5、(3)流式檢測細胞表型cd73、cd90、cd105，收集表達率＞95％的人臍帶間充質干細胞；
6、(4)進行熱循環試驗3～6次，每次熱循環程序包括1～10℃下保持50～70分鐘，24(±2)～26(±2)℃下持續50～70分鐘，流式細胞術檢測細胞存活率及細胞表型變化，收集cd73、cd90
7、(5)2～8℃條件下放置12～15小時，流式細胞術檢測細胞存活率，收集存活率＞90％的人臍帶間充質干細胞；
8、(6)將制劑置于2～5℃穩定性保存箱內，光照強度調整為4000～5500lux，光照6～8小時，收集存活率＞85％的人臍帶間充質干細胞群；
9、(7)冷凍儲存。
10、上述臍帶間充質干細胞制備方法選擇恰當的傳代細胞和細胞密度，依次結合熱循環試驗、2～8℃條件下放置、2～5℃光照處理后，收集特定的細胞群后，制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
11、優選地，所述步驟(2)中，細胞密度為3～8×105/ml。
12、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
13、優選地，所述步驟(4)中，進行熱循環試驗4～5次。
14、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
15、優選地，所述步驟(4)中，25(±2)℃下持續50～70分鐘。
16、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
17、優選地，將制劑置于3.5～4.5℃穩定性保存箱內，光照強度調整為4000～5500lux，光照6～8小時。
18、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
19、優選地，將制劑置于3.5～4.5℃穩定性保存箱內，光照強度調整為4500～5100lux，光照6～8小時。
20、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
21、優選地，胰蛋白胨酶消化物的cas號為91079-40-2。
22、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
23、優選地，所述步驟(1)中，用0.08～0.12mol/l的ph7.4的磷酸鹽緩沖液清洗。
24、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
25、優選地，所述培養基復合液包括dmem和fbs，fbs在培養基復合液中的體積比例為5％～10％。
26、上述臍帶間充質干細胞制備方法制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
27、本專利技術的有益效果在于：本專利技術提供了一種臍帶間充質干細胞制備方法，本專利技術臍帶間充質干細胞制備方法選擇恰當的傳代細胞和細胞密度，依次結合熱循環試驗、2～8℃條件下放置、2～5℃光照處理后，收集特定的細胞群后，制備得到的臍帶間充質干細胞，冷凍保存時間長，冷凍保存后存活率更高。
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1.一種臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，細胞密度為3～8×105/mL。
3.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，進行熱循環試驗4～5次。
4.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，25(±2)℃下持續50～70分鐘。
5.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，將制劑置于3.5～4.5℃穩定性保存箱內，光照強度調整為4000～5500Lux，光照6～8小時。
6.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，將制劑置于3.5～4.5℃穩定性保存箱內，光照強度調整為4500～5100Lux，光照6～8小時。
7.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，胰蛋白胨酶消化物的CAS號為91079-40-2。
8.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中
9.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述培養基復合液包括DMEM和FBS，FBS在培養基復合液中的體積比例為5％～10％。
...【技術特征摘要】
1.一種臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，細胞密度為3～8×105/ml。
3.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，進行熱循環試驗4～5次。
4.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，25(±2)℃下持續50～70分鐘。
5.根據權利要求1所述臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于，將制劑置于3.5～4.5℃穩定性保存箱內，光照強度調整為4000～5500lux，光照6～8小時。<...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬如彪，徐智峰，張新，李智耀，
申請(專利權)人：廣州沙艾生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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