【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及病毒檢測領域，尤其涉及一種用于豬痘病毒的taqman熒光定量pcr的試劑盒。
技術介紹
1、豬痘是由豬痘病毒(swine?pox?virus，swpv)感染引起的一種溫和的、急性、典型性皮膚病，主要引起皮膚損傷、形成痘疹、囊泡、膿皰、結痂等癥狀，被稱為豬中的“天花”。豬痘是在生豬養殖過程中較為常見的一種病毒性疾病，在全球多個地區均有報道，包括美國、俄羅斯、歐洲、印度和巴西，在我國主要數呈散發性。患病豬個體雖然死亡率不高，但對機體的生產性能有著重要的負面影響，容易導致養殖場經濟效益受到影響。
2、2022年，猴痘在歐洲爆發并迅速在全球蔓延，報道了多起死亡病例，迄今為止仍在世界各地有著深遠的影響。作為與其同科的豬痘病毒是否會存在進化加速，目前也成為研究人員的關注點。同時豬痘與口蹄疫、濕疹、豬水皰病和豬丹毒等病癥狀相似，容易引起誤診。鑒于以上原因，建立一種快速、特異、靈敏鑒別豬群感染swpv的方法具有十分重要的意義。
3、taqman實時熒光定量pcr適合用于臨床疾病診斷，且各種類型的樣本都適用，包括dna、rna、基因組和轉錄組等,它是一種更快、更敏感和更具體的方法，盡管探針的成本較高，但是因為其優點廣泛應用于臨床診斷、醫藥研究、分子生物研究等方面。根據現有公開文獻的記載，目前尚未將taqman實時熒光定量pcr技術用于檢測豬痘病毒。國內外目前檢測豬痘病毒的主要方法是通過靶向豬痘病毒p35蛋白基因、p42基因、vltf-3基因和orf18-20進行常規pcr檢測。雖然常規pcr檢測成本低，但是特
4、因此，本專利技術擬針對上述技術現狀，提出一種快速、高效檢測出病毒的新技術。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是，克服現有技術的不足，提供一種用于豬痘病毒的taqman熒光定量pcr的試劑盒。
2、為解決技術問題，本專利技術的解決方案是：
3、提供一種用于taqman熒光定量pcr法檢測豬痘病毒的試劑盒，包括：
4、(1)反應總體積1/2的2×premix?ex?taq酶；
5、(2)濃度各為10μmol/l的上游引物和下游引物；
6、該兩條引物的核苷酸序列分別如seq?id?no：1和seq?id?no：2所示，用于在pcr擴增過程中特異性擴增豬痘病毒中央編碼區外圍c20l-c1l序列中的orf16基因；
7、(3)濃度為10μmol/l的探針，其核苷酸序列如seq?id?no：3所示；
8、(4)標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋；
9、(5)余量為無菌雙蒸水。
10、作為本專利技術的優選方案，所述探針的序列5端標記的熒光基團為fam，序列3’端標記的淬滅基團為bhq1。
11、作為本專利技術的優選方案，所述標準陽性模版為豬痘病毒dna，包含orf16基因第1～第207bp序列。
12、作為本專利技術的優選方案，所述標準陽性模版經所述引物擴增后，所得的擴增產物與pmd18-t載體連接后獲得標準質粒dna；編碼所述擴增產物的基因具有seq?id?no:4所示的核苷酸序列。
13、本專利技術進一步提供了利用前述試劑盒檢測豬痘病毒的taqman熒光定量pcr檢測方法，該方法用于非診斷目的，其操作流程如下：
14、(1)核酸提取：提取待檢樣品中的dna；
15、(2)熒光定量pcr：以提取的核酸為模板，使用所述引物和探針進行taqman熒光定量pcr，獲得擴增曲線；
16、(3)結果判斷：根據預先建立的標準曲線對擴增曲線進行分析，以確定樣本中含有豬痘病毒的情況。
17、作為本專利技術的優選方案，所述步驟(2)中熒光定量pcr的反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火延伸34s，共計40個循環。
18、作為本專利技術的優選方案，所述步驟(2)中熒光定量pcr的反應體系如下所示：
19、premix?ex?taq(probe?qpcr)(2×)10μl；10μmol/l上游引物1μl；10μmol/l下游引物1μl；10μmol/l探針0.4μl；dna模板2μl；dddh2o補足至20μl。
20、作為本專利技術的優選方案，所述步驟(3)中，根據下述方法確定樣本中含有豬痘病毒的情況：
21、(a)陽性對照組需有標準s曲線產生；
22、(b)在陰性對照組無曲線產生的情況下，如果待檢樣品出現典型的s曲線且ct值≦37，判定為豬痘核酸陽性；如果ct值>37或是無ct值，則判定為豬痘病毒核酸陰性。
23、作為本專利技術的優選方案，所述步驟(3)中，根據下述方法確定樣本中的豬痘病毒含量：
24、將標準陽性模版進行連續10倍稀釋，獲得系列拷貝數梯度的標準質粒dna；按照設定的反應體系和反應程序，每個濃度重復三次進行擴增；反應結束后，根據起始模版拷貝數的對數值和c(t)值繪制標準曲線，并根據標準曲線和所得的待檢樣品c(t)值計算起始模版拷貝數，從而實現豬痘病毒的定量分析；
25、所述標準曲線的公式如下所示：
26、y＝ax+b,r2；
27、其中，y為拷貝數；x為ct值；a,b均為常數；r2為決定系數。
28、專利技術原理描述：
29、豬痘病毒(swine?pox?virus，swpv)的成熟病毒粒子呈磚形或橢圓形，有囊膜，是最大型病毒，在水平方向大小約為320nm×240nm。病毒粒子由一個中央雙側凹陷的核，兩個橫向的橢圓體和至少兩層質膜組成。swpv的基因組約為146kb的雙股dna，含有150個閱讀框[0rf]，a+t含量為72.5％。和其它種屬的痘病毒一樣，包含一個139023bp的保守中心基因編碼區，該基因區域含有病毒復制和感染的必需基因，包括毒力、宿主范圍和組織嗜性的有關基因。基因組的末端有2個反向末端重復序列(identleal?invertedtermlnal?repeat,itr)，功能可能與調節或逃逸宿主的免疫應答、調節或抑制宿主細胞凋亡、細胞和組織嗜性等有關。
30、在進化生物學和遺傳學中，保守序列是指代代發生在不同或相同物種中的相同或相似的dna或rna或氨基酸(蛋白質)序列。這些序列的組成變化很小，有時甚至幾代都沒有變化。在擴增基因序列時，選擇在保守區域設計引物能夠更有效的擴增未知的基因。因此，首先找出目的序列中的保守區域并在保守區域內設計引物，也就成為本領域研究人員在引物設計過程中的一種慣性思維。由于豬痘病毒的保守基因數量巨大，要想以逐一排除法針對每一個保守基因進行引物探針設計，然后通過pcr檢測驗證其有效性，顯然是不現實的做法。目前國內外研究人員普遍的做法是，將關注點放在豬痘病毒中央編碼區內的保守基因，在有限的小范圍內進行引物設計及驗證工作。因此，目前常用的主要豬痘病毒靶向基因(如p35蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于TaqMan熒光定量PCR法檢測豬痘病毒的試劑盒，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的序列5端標記的熒光基團為FAM，序列3’端標記的淬滅基團為BHQ1。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述標準陽性模版為豬痘病毒DNA，包含ORF16基因第1～第207bp序列。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述標準陽性模版經所述引物擴增后，所得的擴增產物與pMD18-T載體連接后獲得標準質粒DNA；編碼所述擴增產物的基因具有SEQ?ID?NO:4所示的核苷酸序列。
5.利用權利要求1所述試劑盒檢測豬痘病毒的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，該方法用于非診斷目的，其特征在于，其操作流程如下：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光定量PCR的反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火延伸34s，共計40個循環。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中熒光定量PCR的反應體系如下所示：p>
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，根據下述方法確定樣本中含有豬痘病毒的情況：
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，根據下述方法確定樣本中的豬痘病毒含量：
...【技術特征摘要】
1.一種用于taqman熒光定量pcr法檢測豬痘病毒的試劑盒，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的序列5端標記的熒光基團為fam，序列3’端標記的淬滅基團為bhq1。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述標準陽性模版為豬痘病毒dna，包含orf16基因第1～第207bp序列。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述標準陽性模版經所述引物擴增后，所得的擴增產物與pmd18-t載體連接后獲得標準質粒dna；編碼所述擴增產物的基因具有seq?id?no:4所示的核苷酸序列。
5.利用權利要求1所述試劑盒...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周興東，宋厚輝，王曉杜，朱偉群，周瑩珊，董婉玉，杜靜，趙爽爽，
申請(專利權)人：浙江農林大學，
類型：發明
國別省市：
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