【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及酶工程，尤其涉及一種手性醫(yī)藥中間體的酶法合成。
技術(shù)介紹
1、l-哌啶-2-甲酸(l-pipecolic?acid,l-pa)是一種有機(jī)化合物，其是合成許多重要藥物群的關(guān)鍵手性成分，如局麻藥羅哌卡因、布比卡因和氯普魯卡因，同時(shí)l-哌啶-2-甲酸也是合成主要的大環(huán)內(nèi)酯類化合物免疫制劑的中間體，如雷帕霉素、硫利達(dá)嗪和安莎霉素。與其他對(duì)映體的制備類似，純l-pa主要通過(guò)化學(xué)對(duì)映選擇性合成和立體選擇性轉(zhuǎn)化制備。然而，商業(yè)規(guī)模制備l-pa的化學(xué)方法需要有害的底物、昂貴的金屬催化劑和復(fù)雜的產(chǎn)品純化過(guò)程，或者步驟比較繁瑣、且產(chǎn)率以及選擇性較低。
2、而微生物酶法則具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)設(shè)備簡(jiǎn)單、反應(yīng)初始底物廉價(jià)易得、污染低等優(yōu)點(diǎn)。目前微生物酶法催化合成l-哌啶-2-甲酸主要是通過(guò)兩種途徑：(1)利用葡萄糖脫氫酶、△1-哌啶-2-羧化酶還原酶和l-賴氨酸α-氧化酶進(jìn)行三酶耦連反應(yīng)，但是這種方法催化反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)得率低；(2)利用賴氨酸環(huán)化脫氨酶(lysine?cyclodeaminase,lcd)通過(guò)結(jié)合環(huán)化和脫氨過(guò)程，一步催化線性l-賴氨酸雜環(huán)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀l-pa，但由于可溶性蛋白表達(dá)水平低，底物和產(chǎn)物抑制嚴(yán)重，無(wú)法實(shí)現(xiàn)l-pa的有效積累。
3、盡管目前有較多研究者們通過(guò)研究生物酶法催化合成l-哌啶-2-甲酸，但主要是通過(guò)兩種及以上的多種酶進(jìn)行生物催化或者利用工程菌株高密度、長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵進(jìn)行l(wèi)-哌啶-2-甲酸的合成，而對(duì)于利用賴氨酸環(huán)化脫氨酶進(jìn)行一步酶法催化l-賴氨酸合成l-哌啶-2-甲酸的方法研究較少，然
4、然而，天然來(lái)源的賴氨酸環(huán)化脫氨酶在較高的反應(yīng)溫度(50℃)下具有很好的活性，但是在常溫如25℃下催化活性急劇降低，大大降低了其工業(yè)化應(yīng)用的潛力。因此，通過(guò)提高l-哌啶-2-甲酸合成中賴氨酸環(huán)化脫氨酶的活性進(jìn)而提高l-哌啶-2-甲酸產(chǎn)量，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決上述問(wèn)題，第一方面，本專利技術(shù)提供了一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶、突變體，其能夠催化合成l-哌啶-2-甲酸。
2、本專利技術(shù)解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案如下：
3、本專利技術(shù)提供了一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶來(lái)源于streptomyces?pristinaespiralis；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列為seq?id?no.1；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.6。
4、本專利技術(shù)還提供了一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為上述的賴氨酸環(huán)化脫氨酶的突變體；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為相對(duì)于野生型賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列seq?id?no.1，僅存在第148位的丙氨酸突變、第212位的丙氨酸突變中的一個(gè)突變或組合突變。
5、作為優(yōu)選，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為相對(duì)于所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列seq?id?no.1，僅存在第148位的丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷⒌?48位的丙氨酸突變?yōu)榱涟彼帷⒌?12位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第212位的丙氨酸突變?yōu)榫彼幔械囊粋€(gè)突變或組合突變。
6、作為優(yōu)選，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2、seq?idno.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5所示。
7、本專利技術(shù)還提供了一種編碼基因，所述編碼基因?yàn)榫幋a上述的賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體的基因，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.7、seq?id?no.8、seq?id?no.9、seqid?no.10所示。
8、相對(duì)于野生型賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列seq?id?no.1，僅存在第148位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔瑢⒌玫降馁嚢彼岘h(huán)化脫氨酶突變體命名為splcd-a148m，其氨基酸序列為seq?id?n0.2，其編碼基因的核苷酸序列為seq?id?n0.7。
9、相對(duì)于野生型賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列seq?id?no.1，僅存在第148位丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔瑢⒌玫降馁嚢彼岘h(huán)化脫氨酶突變體命名為splcd-a148l，其氨基酸序列為seq?id?n0.3，其編碼基因的核苷酸序列為seq?id?n0.8。
10、相對(duì)于野生型賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列seq?id?no.1，僅存在第212位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，將得到的賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體命名為splcd-a212v，其氨基酸序列為seq?id?n0.4，其編碼基因的核苷酸序列為seq?id?n0.9。
11、相對(duì)于野生型賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列seq?id?no.1，僅存在第212位丙氨酸突變?yōu)榫彼幔瑢⒌玫降馁嚢彼岘h(huán)化脫氨酶突變體命名為splcd-a212r，其氨基酸序列為seq?id?n0.5，其編碼基因的核苷酸序列為seq?id?n0.10。
12、上述賴氨酸環(huán)化脫氨酶及其突變體堿基序列全長(zhǎng)均為1083bp，從第一個(gè)堿基起至第1083個(gè)堿基止，起始密碼子為atg，終止密碼子為taa。
13、本專利技術(shù)還提供了一種重組載體，所述重組載體含有上述賴氨酸環(huán)化脫氨酶或突變體的編碼基因。
14、進(jìn)一步優(yōu)選，所述重組載體為pet-28a(+)。
15、本專利技術(shù)還提供了一種基因工程菌，所述基因工程菌中導(dǎo)入了上述重組載體。
16、進(jìn)一步優(yōu)選，所述基因工程菌為e.coli?bl21(de3)。
17、本專利技術(shù)上述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體的獲取是采用nnk密碼子定點(diǎn)飽和突變技術(shù)，使用該技術(shù)對(duì)賴氨酸環(huán)化脫氨酶(seq?id?no.1)進(jìn)行突變，將獲得的突變質(zhì)粒以42℃熱擊方式轉(zhuǎn)入e.coli?bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)獲得菌株進(jìn)行接種、轉(zhuǎn)接、誘導(dǎo)、菌體回收。
18、具體方法如下：第一步將野生型出發(fā)菌株活化，獲得了野生型出發(fā)e.coli?bl21(de3)/pet28a(+)-splcd，提取質(zhì)粒pet28a(+)-splcd，并保存于-20℃。第二步通過(guò)alphafold進(jìn)行三維建模，并進(jìn)行分子對(duì)接，選擇合適的突變位點(diǎn)，選擇的主要位點(diǎn)是底物進(jìn)入活性中心的底物通道上的氨基酸殘基，設(shè)計(jì)nnk密碼子突變引物，以pet28a(+)-splcd為模板質(zhì)粒，進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，獲得突變質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化，進(jìn)行優(yōu)勢(shì)突變菌的篩選，獲得賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體splcd-a148m(記為a148m)、splcd-a148l(記為a148l)、splcd-a212v(記為a212v)、splcd-a212r(記為a212r)。
19、第二方面，本專利技術(shù)還提供了一種合成l-哌啶-2-甲酸的方法，以l-賴氨酸為主要底物，以上述賴氨酸環(huán)化脫氨酶或賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為生物催化劑，在緩沖溶液中進(jìn)行催化反應(yīng)，合成l-哌啶-2-甲酸。
20、作為優(yōu)選，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶或突變體的加入形式包括：包含所述賴氨酸環(huán)化脫本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶，其特征在于，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶來(lái)源于Streptomycespristinaespiralis；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.6。
2.一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體，其特征在于，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為權(quán)利要求1所述的賴氨酸環(huán)化脫氨酶的突變體；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為相對(duì)于野生型賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列SEQ?ID?NO.1，僅存在第148的位丙氨酸突變、第212位的丙氨酸突變中的一個(gè)突變或組合突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體，其特征在于，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5所示。
4.一種編碼基因，其特征在于，所述編碼基因?yàn)榫幋a權(quán)利要求3所述的賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體的基因，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.8、SEQ?ID?NO.9、SEQ?ID?NO.10
5.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的編碼基因或權(quán)利要求4所述的編碼基因。
6.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中導(dǎo)入了權(quán)利要求5所述的重組載體。
7.一種合成L-哌啶-2-甲酸的方法，其特征在于，以L-賴氨酸為主要底物，以權(quán)利要求1中所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶或權(quán)利要求2中所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為生物催化劑，在緩沖溶液中進(jìn)行催化反應(yīng)，合成L-哌啶-2-甲酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成L-哌啶-2-甲酸的方法，其特征在于，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶或突變體的加入形式包括：包含所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶或突變體的基因工程菌濕菌體、表達(dá)所賴氨酸環(huán)化脫氨酶及其突變體的細(xì)胞破碎液或所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶及其突變體的基因工程菌濕菌體經(jīng)細(xì)胞破碎、蛋白純化后分離出的純酶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的合成L-哌啶-2-甲酸的方法，其特征在于，催化反應(yīng)體系中，所述L-賴氨酸的濃度為50～150g/L，菌體濃度為50～150g?WCW/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成L-哌啶-2-甲酸的方法，其特征在于，所述催化反應(yīng)中添加硫酸亞鐵作為輔因子、添加Triton作為細(xì)胞表面活性劑。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶，其特征在于，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶來(lái)源于streptomycespristinaespiralis；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列為seq?id?no.1；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶的編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.6。
2.一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體，其特征在于，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為權(quán)利要求1所述的賴氨酸環(huán)化脫氨酶的突變體；所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體為相對(duì)于野生型賴氨酸環(huán)化脫氨酶的氨基酸序列seq?id?no.1，僅存在第148的位丙氨酸突變、第212位的丙氨酸突變中的一個(gè)突變或組合突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體，其特征在于，所述賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5所示。
4.一種編碼基因，其特征在于，所述編碼基因?yàn)榫幋a權(quán)利要求3所述的賴氨酸環(huán)化脫氨酶突變體的基因，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.7、seq?id?no.8、seq?id?no.9、seq?id?no.10所示。
5.一種重組載體，其特征在于，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：薛亞平，胡裕升，李樹(shù)芳，鄭裕國(guó)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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