【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于納米藥物制備領(lǐng)域，具體涉及一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法。
技術(shù)介紹
1、腫瘤免疫治療已經(jīng)應(yīng)用于多種惡性實體瘤的臨床治療，然而，由于腫瘤免疫抑制微環(huán)境的存在，僅有不到20％的患者可以對免疫治療產(chǎn)生良好的響應(yīng)。由于腫瘤細胞代謝旺盛導(dǎo)致的大量乳酸通過“瓦氏效應(yīng)”在腫瘤組織的堆積是腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成的重要原因。過量的乳酸可以導(dǎo)致效應(yīng)t細胞失活并為調(diào)節(jié)t細胞的活動提供能量，從而顯著抑制腫瘤對免疫治療的響應(yīng)。因此，降低腫瘤微環(huán)境中的乳酸水平對于緩解甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境從而提高免疫治療效果具有重要價值。
2、乳酸氧化酶是一種能催化乳酸氧化生成丙酮酸和過氧化氫的黃素蛋白，通過乳酸氧化酶催化降解腫瘤內(nèi)的乳酸可以有效緩解腫瘤微環(huán)境的免疫抑制功能。然而由于乳酸氧化酶缺乏循環(huán)穩(wěn)定性，很容易被人體內(nèi)的蛋白酶降解失活，因此其在腫瘤治療方面的臨床應(yīng)用受到了很大的限制。
3、安全性和有效性問題是判斷藥物療效的主要指標，而乳酸氧化酶本身存在的生物安全性問題是限制其在腫瘤治療中應(yīng)用的另一關(guān)鍵因素。由于乳酸是大多數(shù)正常組織的碳源，乳酸氧化酶造成的非特異性乳酸清除可能會帶來嚴重的副作用。因此如何利用乳酸氧化酶選擇性的清除腫瘤內(nèi)的乳酸而不影響其他組織器官內(nèi)的乳酸含量是決定乳酸氧化酶能否用于腫瘤臨床治療的關(guān)鍵。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是為了提高乳酸氧化酶的循環(huán)穩(wěn)定性并規(guī)避乳酸氧化酶的毒副作用，解決乳酸氧化酶選擇性不強的問題，提供一種用
2、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案如下：
3、一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，所述方法為：
4、步驟一：制備腫瘤微酸環(huán)境響應(yīng)的2-(氮雜環(huán)庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯單體
5、將n-(2-羥乙基)六亞甲二胺，三乙胺溶解于無水四氫呋喃中，隨后滴加甲基丙烯酰氯至上述溶液中，加熱回流后過濾除去不溶的三乙胺鹽酸鹽，隨后通過提純得到腫瘤微酸環(huán)境響應(yīng)的2-(氮雜環(huán)庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯(ca7)單體；
6、步驟二：制備過氧化氫響應(yīng)的nlg919單體
7、將草酰氯溶于無水二氯甲烷中，-5～5℃攪拌25～35分鐘后逐滴滴加2-甲基丙烯酸羥乙酯并繼續(xù)攪拌2～3h；旋蒸除去多余的草酰氯和溶劑后將其加入nlg919的無水二氯甲烷溶液，加入三乙胺將溶液ph值調(diào)整到7-8，-5～5℃攪拌過夜；隨后將溶液過濾旋蒸即得到過氧化氫響應(yīng)的nlg919單體；
8、步驟三：制備腫瘤微酸環(huán)境和過氧化氫雙響應(yīng)的peg-pca7-pnlg919兩親聚合物
9、將2-(氮雜環(huán)庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯單體，過氧化氫響應(yīng)的nlg919單體，聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯和aibn溶解于n，n-二甲基甲酰胺溶液中進行反應(yīng)，透析后去離子水沉淀凍干即得到peg-pca-pnlg919兩親聚合物；
10、步驟四：制備包載乳酸氧化酶的高分子聚合物納米酶
11、將peg-pca7-pnlg919兩親聚合物溶于的四氫呋喃中，并在攪拌過程中逐滴加入溶解有乳酸氧化酶的去離子水，并在室溫下持續(xù)攪拌，鑒于thf具有揮發(fā)性，故隨著thf的揮發(fā)，溶液中的兩親聚合物發(fā)生自組裝并將乳酸氧化酶包進親水內(nèi)核，即得到包載乳酸氧化酶的球狀的納米酶。
12、進一步地，步驟一中，所述n-(2-羥乙基)六亞甲二胺、三乙胺、甲基丙烯酰氯的質(zhì)量比為2～3：2～3：2～3。
13、進一步地，步驟一中，所述提純?yōu)楣枘z柱層析(洗脫液甲醇/乙酸乙酯＝3/1v/v)和懸蒸相配合。
14、進一步地，步驟二中，所述草酰氯、2-甲基丙烯酸羥乙酯、nlg919的質(zhì)量比為5～7：2～4：0.5～1。
15、進一步地，步驟三中，所述2-(氮雜環(huán)庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯單體，過氧化氫響應(yīng)的nlg919單體，聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯和aibn的摩爾比為25～35：25～35：0.8～1.2：0.1～0.5。
16、進一步地，步驟三中，所述反應(yīng)條件為：氮氣保護30分鐘后于75-85℃反應(yīng)24h。
17、進一步地，步驟四中，所述peg-pca7-pnlg919兩親聚合物與乳酸氧化酶的質(zhì)量比為0.1-10：0.06-6。
18、本專利技術(shù)相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：本專利技術(shù)設(shè)計了一種響應(yīng)腫瘤微酸環(huán)境的，載有乳酸氧化酶的高分子聚合物納米載體用于特異性遞送乳酸氧化酶至腫瘤部位，以緩解腫瘤微環(huán)境對免疫系統(tǒng)的抑制作用。該納米藥物遞送平臺可以在體內(nèi)循環(huán)過程中保護包載的乳酸氧化酶不與蛋白酶接觸從而提高乳酸氧化酶的循環(huán)穩(wěn)定性。此外該納米藥物可以通過響應(yīng)腫瘤組織較正常組織偏低的ph環(huán)境改變自身通透性，選擇性的催化氧化腫瘤微環(huán)境中的乳酸而不影響正常組織中的乳酸水平，從而降低乳酸氧化酶的潛在毒副作用。本專利技術(shù)的藥物乳酸氧化酶可以有效改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，增強效應(yīng)t細胞活性并促使調(diào)節(jié)t細胞活力喪失，從而提高免疫治療效果。
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1.一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：所述方法為：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟一中，所述N-(2-羥乙基)六亞甲二胺、三乙胺、甲基丙烯酰氯的質(zhì)量比為2～3：2～3：2～3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟一中，所述提純?yōu)楣枘z柱層析(洗脫液甲醇/乙酸乙酯＝3/1v/v)和懸蒸相配合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟二中，所述草酰氯、2-甲基丙烯酸羥乙酯、NLG919的質(zhì)量比為5～7：2～4：0.5～1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟三中，所述2-(氮雜環(huán)庚烷-1-基)乙基甲基丙烯酸酯單體，過氧化氫響應(yīng)的NLG919單體，聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯和AIBN的摩爾比為25～35：2
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟三中，所述反應(yīng)條件為：氮氣保護30分鐘后于75-85℃反應(yīng)24h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟四中，所述PEG-PCA7-PNLG919兩親聚合物與乳酸氧化酶的質(zhì)量比為0.1-10：0.06-6。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：所述方法為：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟一中，所述n-(2-羥乙基)六亞甲二胺、三乙胺、甲基丙烯酰氯的質(zhì)量比為2～3：2～3：2～3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟一中，所述提純?yōu)楣枘z柱層析(洗脫液甲醇/乙酸乙酯＝3/1v/v)和懸蒸相配合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的高分子聚合物納米酶的制備方法，其特征在于：步驟二中，所述草酰氯、2-甲基丙烯酸羥乙酯、nlg919的質(zhì)量比為5～7：2～4：0.5～1。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊奎琨，
申請(專利權(quán))人：哈爾濱工業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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